高效液相色谱法测定饲料香味剂中香芹酚和百里香酚含量的研究

2010-06-29辽宁省兽药饲料监察所杨希国李永才

中国饲料 2010年1期

辽宁省兽药饲料监察所杨希国李永才

香芹酚和百里香酚是《饲料添加剂品种目录（2008）》（中华人民共和国农业部公告第1126号）规定的允许在养殖动物中使用的饲料香料剂。目前尚无检测饲料香味剂中香芹酚和百里香酚的国家标准、行业标准及报道。本研究建立了饲料香味剂中香芹酚和百里香酚含量测定的高效液相色谱法，本方法操作简便、准确可靠、选择性好，为香味剂的检测提供了技术支持。

1 试验方法

1.1 仪器 Waters 2695型液相色谱仪（配二极管阵列检测器）；超声波清洗器；电子天平（精度0.0001 g和 0.00001 g）。

1.2 试剂和溶液冰醋酸、甲醇为色谱纯；95%乙醇为分析纯；香芹酚（Sigma公司，纯度98%）；百里香酚（Sigma公司，纯度99%）；流动相：甲醇+水+冰醋酸（60+40+2）；标准溶液：精密称取香芹酚500 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为10 mg/mL的香芹酚标准贮备液。精密称取百里香酚500 mg，置50 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为10 mg/mL的百里香酚标准贮备液。临用前，将香芹酚标准贮备液和百里香酚标准贮备液用甲醇稀释成浓度为 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的标准工作液。

1.3 色谱条件色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱（粒度为 5 μm，柱长 250 mm，内径 5 mm）；流速为0.7 mL/min；检测波长为 274 nm；进样体积为 20 μL；柱温为 30 ℃。

1.4 样品测定

1.4.1 样品提取称取饲料香味剂样品2 g（精确至0.0001 g），置于250 mL容量瓶中，加甲醇超声提取30 min，定容，过0.45 μm的滤膜，供液相色谱测定。

1.4.2 样品测定取20 μL处理好的样品注入高效液相色谱仪中，以保留时间定性，以峰面积外标法定量。

1.5 回收率及精密度测定精密称取饲料香味剂2 g，置于250 mL容量瓶中，添加香芹酚和百里香酚标准物质，按1.4方法测定，计算回收率和精密度。

1.6 定量限测定添加不同水平香芹酚和百里香酚的饲料香味剂，按1.4方法检测，定量限以信噪比大于等于10（S/N≥ 10）计算。

2 结果

2.1 波长选择取0.1 mg/mL的香芹酚和百里香酚标准溶液进行波长扫描，结果在274.5 nm处有最大吸收波长（见图1）。用274 nm检测时无杂质峰干扰，香芹酚和百里香酚能完全分离。

图1 香芹酚和百里香酚波长扫描图谱

2.2 色谱图标准溶液的液相色谱图见图2。图2表明，香芹酚和百里香酚得到了很好的基线分离，峰形对称，无杂质峰干扰。

2.3 线性关系考察配制浓度为 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的香芹酚和百里香酚系列标准工作液后进行测定，结果香芹酚标准曲线为Y=23600X+7664.8，百里香酚标准曲线为Y=23787X+7740.1，相关系数均大于0.9999，结果表明，香芹酚和百里香酚在1.0～500.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.4 回收率和精密度测定结果对某样品进行了11次测定，结果香芹酚和百里香酚的平均含量分别为23.5 mg/g和22.8 mg/g。对该样品进行了添加回收率实验。称取2 g样品，加入5 mg香芹酚和百里香酚，结果见表1。测得香芹酚的回收率为96.8% ～99.2%，平均回收率为98.2%，变异系数为1.0%；百里香酚的回收率为97.6%～101.4%，平均回收率为99.5%，变异系数为1.6%，该方法回收率高、重现性好。

2.5 定量限测定结果添加不同水平香芹酚和百里香酚的饲料香味剂，按上述方法检测，当添加水平为50 mg/kg时，其信噪比均大于10（S/N>10），因此，确定方法的定量限为50 mg/kg。

表1 香芹酚和百里香酚的添加回收率和精密度

3 讨论

3.1 提取香芹酚和百里香酚均能溶于醇、醚和碱溶液等，不溶或微溶于水。本研究分别考察了甲醇、无水乙醇和95%乙醇对饲料香味剂中香芹酚和百里香酚的超声提取效果，结果表明无水乙醇和95%乙醇提取的回收率相仿，略低于甲醇提取的回收率。超声时间30 min以上提取效果几乎无变化。故选甲醇超声提取30 min为样品提取方法，此方法回收率高，样品杂质少，对检测无干扰。

3.2 检测条件香芹酚和百里香酚属同分异构体，其沸点相差约5℃，气相色谱分离较难；本研究采用高效液相色谱法Symmetry C18色谱柱分离，紫外检测器检测，考察了甲醇+水+冰醋酸（60+40+2）和乙腈+水（65+35）作为流动相的检测效果，结果显示乙腈和水作为流动相色谱峰的对称性差，而甲醇、水和冰醋酸混合作为流动相香芹酚和百里香酚得到了很好的基线分离，峰形对称，无杂质干扰。