腺苷后处理对大鼠缺血再灌注心肌NF-κB和IL-1β的影响

田 金,王 雄

心肌缺血再灌注损伤是临床上常见的病理生理过程,其机制与炎症因子的产生有关,寻找能有效减少炎性因子水平的药物,已成为缺血再灌注药物研究的重要方面。腺苷作为机体一种重要的内源性活性物质,其心脏保护作用成为近几年研究的热点[1-3],腺苷预处理可抑制缺血再灌注后的炎性反应[4]。本研究拟进一步观察在缺血再灌注后给药对大鼠心肌细胞核因子κ B(NF-κ B)及白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,以明确腺苷后处理是否和缺血预适应同样具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 雄性清洁级Wistar大鼠(由山西医科大学实验动物中心提供),体重(220～250)g,经20%乌拉坦(5 ml/kg)腹腔麻醉,以针形电极插四肢皮下,观察记录标准Ⅱ导联心电图。以小动物呼吸机行机械通气。开胸暴露心脏,在左冠状动脉前降支距左心耳下缘2 mm处穿过丝线,提起后以套管夹闭造成冠状动脉阻塞。心肌缺血依据心电图ST段抬高确认;再灌注依据ST段恢复确认。手术结束后输入液体,控制30 min后开始实验。

1.2 动物分组及处理 32只大鼠随机分为4组,每组8只。假手术组:开胸只穿线不结扎血管,麻醉维持150 min;缺血再灌注组(I/R):结扎 LAD 30 min,再灌注 120 min;缺血后处理组:缺血30 min,再灌注30 s停止灌注30 s,重复 3次,再灌注120 min;腺苷组:结扎 LAD 30 min后,股静脉缓慢滴注腺苷305 μ g/(kg◦min),持续 5 min,再灌注 120 min。

1.3 光镜观察 各组切取相同部位心尖部心肌组织,光镜下观察心肌结构变化。

1.4 心肌组织NF-κ B的活化及免疫组化检测 按非生物素二步法免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)说明书操作,取石蜡切片按程序脱蜡,3%(v/v)H2O2灭活内源性酶,微波抗原修复,以 1∶100的兔抗大鼠NF-κ B65多克隆抗体为一抗,山羊抗兔IgG为二抗,加酶标记物,DAB显色,光镜下观察。应用Leica图像分析系统进行分析。每张切片随机选取10个区域,计算每个区域中染色部分占整个区域面积的百分比,以均值表示每个心肌中阳性信号面积。

1.5 心肌组织中IL-1β含量的测定 取0.05 g的心肌组织,用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)在4℃条件下匀浆,再离心20 min,转速1 200/min,取上清液用于 IL-1β测定,根据 ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)中提供的步骤操作,测出IL-1β含量。

2 结 果

2.1 腺苷对心肌组织形态学的影响 假手术组心肌细胞排列整齐,心肌纤维完整,排列整齐,着色均匀,无变性坏死,间质未见炎性细胞浸润。I/R组心肌细胞排列紊乱,心肌纤维着色不均,排列紊乱,部分心肌纤维断裂,心肌细胞呈现大片状坏死,坏死区域红染、界线不清,间质可见大量炎性细胞浸润。缺血后处理组同腺苷后处理组心肌细胞排列较I/R组整齐,心肌纤维着色不均,排列紊乱,可见点灶状坏死,坏死范围比I/R组小,间质可见少量炎性细胞浸润。

2.2 腺苷对心肌NF-κ B表达的影响 假手术组NF-κ B的表达面积较小。I/R组NF-κ B的表达面积大,范围广,并可见有细胞核内表达,说明有部分NF-κ B在活化过程中转移到核内。缺血后处理及腺苷后处理组的NF-κ B表达的阳性面积均明显小于I/R组,且其阳性表达的强度也要弱于I/R组(P＜0.01);而缺血后处理及腺苷后处理组之间进行统计学比较无明显差异;I/R组、缺血后处理组及腺苷后理组明显大于假手术组(P＜0.01)。详见表1。

2.3 腺苷对心肌IL-1β含量的影响 缺血后处理组与腺苷后理组大鼠心肌IL-1β水平较I/R组明显下降(P＜0.01);而腺苷处理组与缺血后处理组心肌中IL-1β水平无统计学意义(P＞0.05);I/R组、缺血后处理组及腺苷后理组较假手术组心肌IL-1β水平明显升高(P＜0.01)。详见表1。

表1 大鼠心肌组织NF-κ B面积和IL-1β含量比较(±s)

表1 大鼠心肌组织NF-κ B面积和IL-1β含量比较(±s)

组别 鼠数(只)NF-κ B面积(%) IL-1β(pg/g)假手术组 8 9.98±5.01 22.36±3.2 I/R组 8 51.55±8.651) 60.25±5.081)缺血后处理组 8 33.40±4.691)2) 39.70±4.971)2)腺苷后处理组 8 31.63±5.431)2) 38.87±5.311)2)与假手术组比较,1)P＜0.01;与I/R组比较,2)P＜0.01

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤的发生机制与诸多因素有关,如氧自由基(OFR)的作用、钙超载、内皮细胞的激活,炎症反应的作用,细胞黏附分子(ICAM-1)[5]和NF-κ B[6]等在心肌缺血-再灌注损伤的发生中皆起着非常重要的作用。腺苷是目前在动物实验和临床研究中都证实对缺血再灌注损伤有一定保护作用的药物[7]。腺苷作为机体一种重要的内源性活性物质,可触发和介导缺血预适应,减轻缺血再灌注损伤,减少无复流现象,从而起到心肌保护作用。很多研究表明腺苷A2a受体产生细胞效应来抑制炎症反应,减少单核细胞释放肿瘤坏死因子[8],降低血小板活性[9],而且抑制淋巴细胞活性[10]。本研究显示,腺苷后处理对缺血再灌注心脏起保护作用,病理损伤减轻,NF-κ B的表达下降以及炎性细胞因子IL-1β的分泌降低。

NF-κ B是一个广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子,参与机体的炎症反应、免疫反应、细胞分化与凋亡及其他应激反应[11]。细胞处于静息状态时,NF-κ B与它抑制因子 Iκ B结合在一起,以无活性的同源或异源二聚体形式存在于多种组织的细胞质中。NF-κ B在心肌I/R损伤中发挥着重要作用,其在缺血、再灌注、氧自由基、白介素等刺激下而激活[12,13],通过一系列细胞信号转导引起活化,活化的NF-κ B从胞质转移入细胞核,与靶基因的κ B位点结合而促进炎性细胞因子增加[14],加重组织器官功能的损伤,导致炎症反应、细胞坏死和细胞凋亡。本研究发现大鼠心肌组织在缺血再灌注后,NF-κ B活性明显增加,IL-1β表达增强,可证明心肌缺血再灌注确实有炎性反应存在;而给予腺苷后处理后,NF-κ B活化被明显抑制,同时,IL-1β的表达也显著减少,说明腺苷后处理可以抑制NF-κ B的激活,降低炎性细胞因子 IL-1β的表达,从而减轻心脏的炎性反应。

本研究结果显示,腺苷后处理对大鼠缺血再灌注心肌具有保护作用,其部分保护作用机制可能与腺苷后处理抑制NF-κ B活化,从而减少IL-1β的表达,减轻炎症反应有关。具体中间机制尚有待进一步研究。

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