柴桂温胆定志汤对抑郁模型大鼠海马BDNF和TrκB的影响

陈建，王贺，林久茂，郑良朴，郝万山（.福建中医药大学中医学院，福建福州5008；.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州5008；.北京中医药大学基础医学院，北京0009）

柴桂温胆定志汤对抑郁模型大鼠海马BDNF和TrκB的影响

陈建1，王贺1，林久茂2，郑良朴2，郝万山3
（1.福建中医药大学中医学院，福建福州350108；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350108；3.北京中医药大学基础医学院，北京100029）

目的观察柴桂温胆定志汤对抑郁模型大鼠海马脑源性神经营养因子（BDNF）和特异性受体酪氨酸激酶B（TrκB）的影响。方法将42只SD大鼠随机分为6组，采用长期轻度不可预见性应激加孤养复制大鼠抑郁症模型，运用免疫组织化学法测定大鼠海马BDNF及其TrκB的表达。结果模型组大鼠海马BDNF和TrκB的表达明显低于空白对照组（P＜0.01）；氟西汀组、柴桂温胆定志汤高剂量组大鼠海马BDNF和TrκB的表达皆明显高于模型组（P＜0.01）；柴桂温胆定志汤中剂量组大鼠海马BDNF和TrκB的表达高于模型组（P＜0.05）。结论柴桂温胆定志汤能提高抑郁模型大鼠海马BDNF及其受体TrκB的表达，从而保护海马神经元，可能是其抗抑郁的药理机制之一。

抑郁症；海马；脑源性神经营养因子；酪氨酸激酶B；柴桂温胆定志汤

抑郁症是临床的疑难病，中西医治疗都颇为棘手，随着生活与工作压力的加大，发病率有逐渐上升的趋势。北京中医药大学郝万山教授在临床中反复摸索，创立了柴桂温胆定志汤，用于抑郁症的治疗，取得了良好的效果。笔者在前期研究基础上，采用长期轻度不可预见性应激加孤养复制抑郁症大鼠模型，通过观察大鼠海马BDNF和TrκB表达的变化，探讨柴桂温胆定志汤对抑郁模型大鼠海马神经元的影响，以期阐释该方的抗抑郁机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物盐酸氟西汀胶囊［20 mg／片，Patheon France（法国），批号：8147A］。柴桂温胆定志汤组成：柴胡10 g，黄芩10 g，桂枝10 g，赤芍10 g，白芍10 g，半夏10 g，生姜10 g，陈皮10 g，枳壳10 g，竹茹10 g，茯苓20 g，人参5 g，石菖蒲6 g，远志10 g，大枣5枚，炙甘草6 g。中药饮片由福建中医药大学国医堂提供。

1.1.2 试剂多聚赖氨酸；BDNF抗体（美国SANTACRUZ公司，批号：B0626）；TrκB抗体（美国SANTA CRUZ公司，批号：D0809）；SP试剂盒（河北博海生物工程开发有限公司，批号：701323A）；DAB染色试剂盒（河北博海生物工程开发有限公司，批号：673767A）等。

1.1.3 实验动物清洁级成年SD大鼠42只，雌雄各半，体重（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号：0054756。

1.1.4 主要仪器显微镜（日本奥林巴斯，BX51TPHD-J11）；多功能真彩色细胞图象分析管理系统（美国Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus）；切片机（德国莱卡，RM2015）等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组大鼠购进后，适应性饲养1周，随机分为6组，每组7只，即正常对照组（NC组）、模型对照组（MC组）、氟西汀组（FC组）、柴桂温胆定志汤高剂量组（CG组）、柴桂温胆定志汤中剂量组（CZ组）、柴桂温胆定志汤低剂量组（CD组）。

1.2.2 造模参照文献［1］，空白组自由饮水摄食，不予任何刺激。其余各组大鼠1只／笼，孤养。自分组之日起，连续给予21 d各种未预知的应激，包括24 h禁食，24 h禁水，通宵照明，4℃冷水游泳5 min，40℃烘箱热烘5min，夹尾1min，100伏电击足底1min，悬尾1 min等刺激。每日从以上的刺激中随机选择1种，顺序随机，使动物不能预知给予的刺激，制备抑郁症大鼠模型。

1.2.3 给药氟西汀以蒸馏水配制成浓度为0.18 mg／mL的药液；柴桂温胆定志汤分别以蒸馏水配置成3.156，1.578，0.789 g／mL高、中、低3种浓度的药液，备用。每组动物于每日上午9：30灌胃，正常对照组和模型对照组每次分别灌服生理盐水10mL／kg；氟西汀组灌服氟西汀药液10mL／kg；中药各剂量组分别灌服相应浓度药液10 mL／kg。人与大鼠用药量换算参考文献方法［2］，各组灌药量均为70 kg成人的等效剂量。在给予应激的第1 d开始灌胃，连续21 d，每日1次。

1.2.4 取材6组大鼠于实验结束的第2 d断头处死，大鼠麻醉后开胸，升主动脉插管，生理盐水冲洗后，继续灌注4%多聚甲醛，取脑后固定，蔗糖内梯度脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片，取海马与齿状回互包平面，切片厚度5μm。

1.2.5 免疫组织化学法测定大鼠海马BNDF、TrκB的表达情况将组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；常规脱蜡至水；1%甲醇双氧水，室温10min，蒸馏水洗1次，0.1MPBS洗3次×5 min；切片上滴加抗原修复液，室温10 min，0.1MPBS洗3次，5min；切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗。切片上滴加第一抗体，4℃过夜，0.1 MPBS洗3次，5min。切片上滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃20min，0.1MPBS洗3次，5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A／HRP），37℃20min，0.1MPBS洗3次，5 min；DAB显色：使用DAB显色试剂盒1 mL蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，加至标本上，显色6 min，充分水洗；苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察并拍片。

1.2.6 免疫组织化学染色半定量分析采用Image Pro Plus多功能真彩色细胞图象分析管理系统，对照大鼠脑立体定位图谱，选择实验组和对照组的阳性和阴性组织相。每张切片选择5个互不重叠的视野，在400倍光镜下分别测量各个视野的BDNF和TrκB阳性细胞数，用单位面积阳性细胞记数和总细胞数的百分比表示该成分的相对含量，取其平均值。

1.3 统计学分析使用SPSS 13.0软件包对数据进行统计分析，所有数据均用均数±标准差（¯x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

实验结果见表1，图1，图2。

表1 各组大鼠海马BDNF和TrκB相对含量比较（¯x±s）

2.1 对大鼠海马BDNF表达的影响光镜下可见BDNF和TrκB免疫组织化学阳性细胞在海马区主要集中干CA1和CA3区锥体细胞和DG颗粒细胞，二者的阳性反应存在于细胞胞浆中，胞核不染色。与NC组相比，MC组大鼠海马的BDNF免疫反应阳性神经元数目明显减少，有显著意义（P＜0.01）；与MC组相比，FC组大鼠海马的BDNF免疫反应阳性神经元数目明显增加，有显著意义（P＜0.01），CG、CZ组大鼠海马的BDNF免疫反应阳性神经元数目明显增加，有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）；CG组与FC组相比较，无统计学意义；中药高、中剂量组相比较，无统计学意义。

2.2 对大鼠海马TrκB表达的影响结果显示，与NC组比较，MC组大鼠海马TrκB免疫反应阳性神经元数目明显减少，有显著意义（P＜0.01）；与MC组相比，FC组大鼠海马的TrκB免疫反应阳性神经元数目明显增加，有显著意义（P＜0.01），CZ、CG组大鼠海马的TrκB免疫反应阳性神经元数目明显增加，有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；CG组与FC组相比较，无统计学意义；中药高、中剂量组相比较，无统计学意义。

图1 各组大鼠海马BDNF免疫组化染色

图2 各组大鼠海马TrκB免疫组化染色

3 讨论

抑郁症的病人往往有情绪低落、兴趣减低、思维迟钝、乏力等症状。临床观察到，病人乏力的症状往往有晨重暮轻的特点，与少阳病的发病特点颇相吻合。少阳为“小阳”，属木行，其阳气生发于清晨。若少阳阳气不足，生发无力，则乏力多表现为晨重暮轻；清阳升发无力，脑窍失充，加之痰浊乘虚上扰，清窍受阻，则思维迟钝。少阳疏泄失职，情志不畅，则见抑郁、心情低落。可见抑郁症的病机与胆阳不足、胆失疏泄、痰浊阻窍有关。柴桂温胆定志汤由经方柴胡桂枝汤、温胆汤以及《千金要方》中的定志小丸组合而成，有疏肝利胆、温阳升清、涤痰开窍等功效，用于抑郁症的治疗，效果良好。

长期轻度不可预见性应激加孤养复制的抑郁症模型能较真实地模拟抑郁症的某些症状和病因，已成为国内外学者探究抑郁症的发病机制及抗抑郁剂作用机理而广泛应用的动物模型。笔者在此模型的基础上，初步研究柴桂温胆定志汤的抗抑郁药理机制。

抑郁症的发病机制较为复杂，有研究表明抑郁症的发生与海马区域神经细胞的萎缩和坏死有关，神经元可塑性失调与抑郁症的发病关系密切［3］。BDNF是神经营养因子家族中的重要成员，是一种具有防止神经元死亡功能的蛋白质，其表达水平的下降参与抑郁症的某些生理、病理过程，可能是抑郁症的基本病理改变之一。TrκB是BDNF特异性高亲和力受体，广泛分布于中枢神经系统，对神经元的生存、生长、分化有重要的影响［4］。研究表明通过高亲和力受体TrκB介导，BDNF能促进突触的可塑性，包括增加突触终末的密度，促进树突和轴突的长出，直接参与调节学习和记忆过程［5］。可见BDNF／TrκB信号传导通路在维持神经元细胞的存活、生长及分化等方面发挥着重要作用［6］。

研究结果显示，模型组大鼠海马BDNF和TrκB的表达明显下降，柴桂温胆定志汤高、中剂量组不同程度地提高大鼠海马BDNF和TrκB的表达。表明慢性应激时大鼠海马BDNF和TrκB的表达降低，BDNF／TrκB信号传导通路失常是抑郁症发病机制的重要环节。提高海马BDNF及其受体TrκB的表达，进而对海马神经元可塑性进行调节，保护海马神经元可能是柴桂温胆定志汤的抗抑郁药理机制之一。当然在柴桂温胆定志汤的抗抑郁过程中，BDNF是如何通过TrκB的介导而达到保护海马神经元作用的，其深入的机制还有待于进一步研究。

［1］Baker SL，Kentner A C，Koukle A T.Behavioraland physiological effects of chronicmild stress in female rats［J］.Physiol Behavior，2006，87（2）：314-322.

［2］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：103.

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［6］温文胜，张哲，谢莹，等.酪氨酸激酶受体B与脑源性神经营养因子mRNA在鼻咽癌中的定量表达［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2009，16（7）：376-379.

R285.5

A

1007－4813（2010）05－0643－03

2010－07－07）

福建省科技厅青年人才资助项目（2007F3044）。

陈建（1974－），男，医学博士，副教授。研究方向：经方辨治情志病症的临床与实验研究。