CD200在AA患者T淋巴细胞上的表达及其与血清中相关细胞因子浓度的关系①

张慧敏 刘清池 潘 邢江涛 张玉娜 (石家庄平安医院,石家庄 050021)

再生障碍性贫血(Aplastic anemia,AA,简称再障)是一组由于物理、化学、生物因素或不明原因引起的骨髓造血功能衰竭的异质性疾病。第46届美国血液学年会明确提出AA是自身免疫性疾病,机体免疫调节机制紊乱在AA发病中起重要作用,大量研究显示细胞免疫功能紊乱与造血衰竭密切相关[1]。AA发病中免疫激活的同时伴有免疫耐受的打破[2]。CD200分子是一种新发现的具有免疫调节功能的分子,与CD200R相互作用能使IL-2、IFN-γ等1型细胞因子生成减少,IL-4、IL-10等2型细胞因子生成增多[3],由此来干预Th细胞的生成与分化,促进免疫耐受。本研究采用流式细胞术检测了60例AA患者和30名健康人外周血T淋巴细胞亚群上CD200的表达率,用ELISA 法检测了血清中 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度,以探讨CD200在AA发病中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 重型再障(SAA)30例、非重型再障(NSAA)30例,男28例,女32例,中位年龄 32.6岁(7～62岁);30名健康志愿者作为正常对照组(NC),男13例,女17例,中位年龄37岁(21～58岁)。

1.2 主要仪器及试剂 四色流式细胞仪及抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体为美国Beckman Coulte公司生产;抗CD200单抗购自美国Invitrogen公司;MK3型酶标仪及自动洗板机为芬兰雷勃公司生产;ELISA试剂盒(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)购自上海西唐生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集 抽取静脉血8 ml,其中5 ml用EDTA抗凝,检测CD200表达率;3 ml收集血清,冷冻保存,待测相关细胞因子浓度。

1.3.2 CD200测定方法 用淋巴细胞分离液分离EDTA抗凝血样本中单个核细胞(PBMC)。向顺序编好号的试管中加入单克隆抗体各10 μ l,加入PBMC悬液100 μ l,室温避光孵育20分钟,溶血,加入PBS缓冲液,离心。应用四色流式细胞仪,以相应荧光标记的同型对照IgG1染色细胞为阴性对照,以CD3阳性细胞设门,测定各T细胞亚群CD200阳性比例。

1.3.3 细胞因子测定方法 采用双抗体夹心法ABC-ELISA。用抗人 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10 单抗包被于酶标板上,标准品与样品中的细胞因子与单抗结合,加入生物素化的第一抗体工作液,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加入终止液,在450 nm处测OD值,求出标准曲线,计算出样本含量。

2 结果

2.1 SAA 、NSAA 患者 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞上CD200的平均表达率均显著低于正常对照组;而SAA组与NSAA组之间无显著性差异,见表1。

表1 再障患者T淋巴细胞亚群上CD200的表达率(±s,%)Tab.1 Expression of CD200 on T lymphocytes from different group of AA patients and normal controls(±s,%)

表1 再障患者T淋巴细胞亚群上CD200的表达率(±s,%)Tab.1 Expression of CD200 on T lymphocytes from different group of AA patients and normal controls(±s,%)

Note:1)P＜0.01,compared with control;2)P＜0.05,compared with control.

Groups n CD200+/CD3+ CD200+/CD3+CD4+ CD200+/CD3+CD8+Control 30 30.164±1.984 24.505±1.816 22.623±1.523 SAA 30 21.137±2.1351) 15.995±1.9541) 16.726±1.6382)NSAA 30 22.118±2.8052) 16.555±2.5682) 16.745±2.1532)

表2 再障患者血清中IL-2、IFN-γ的浓度(±s,ml)Tab.2 Serum levels of IL-2, IFN-γ in different group of AA patients and normal controls( ±s,pg/)

表2 再障患者血清中IL-2、IFN-γ的浓度(±s,ml)Tab.2 Serum levels of IL-2, IFN-γ in different group of AA patients and normal controls( ±s,pg/)

Note:1)P＜0.01,compared with control;2)P＜0.05,compared with control;3)P＜0.01,compared with NSAA.

Groups n IL-2 IFN-γ Control 30 22.859±1.173 21.755±1.565 SAA 30 33.800±1.2631)2) 36.853±1.6841)2)NSAA 30 28.082±1.6593) 27.335±2.2133)

表3 再障患者血清中IL-4、IL10的浓度(±s,pg/ml)Tab.3 Serum levels of IL-4,IL10 in different group of AA patients and normal controls(±s,pg/ml)

表3 再障患者血清中IL-4、IL10的浓度(±s,pg/ml)Tab.3 Serum levels of IL-4,IL10 in different group of AA patients and normal controls(±s,pg/ml)

Note:1)P＜0.01,compared with control;2)P＜0.05,compared with NSAA.

Groups n IL-4 IL-10 Control 30 21.895±0.587 24.814±0.791 SAA 30 14.174±0.6321)2) 17.911±0.8521)2)NSAA 30 16.545±0.8311) 20.827±1.1191)

表4 再障患者CD3+T 淋巴细胞上CD200表达率与血清中相关细胞因子浓度的相关性分析(r 值)Tab.4 The correlation between the expression rate of CD200 on CD3+T lymphocytes and the serum levels of IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10(rvalue)

2.2 SAA、NSAA患者血清中IL-2、IFN-γ的平均浓度均显著高于正常对照组,且SAA组显著高于NSAA组;IL-4、IL-10的平均浓度显著低于正常对照组,且SAA组显著低于NSAA组。见表2、3。

2.3 AA患者CD3+T淋巴细胞上CD200表达率与血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平均呈负相关。见表 4。

3 讨论

CD200分子是在2000年人白细胞分化抗原研讨会上被命名的I型膜糖蛋白,广泛表达在人类胸腺细胞、B淋巴细胞、激活的T淋巴细胞、滤泡状树突细胞、内皮细胞等。CD200与CD200R相互作用,可以提供负调控信号,减低髓系细胞(单核细胞和巨噬细胞)活性,诱导Th1向Th2“克隆转换”,引起免疫低应答的产生,并可以下调动物对自身免疫病的敏感性。敲除CD200基因的鼠体内髓系细胞的数量和活性都高于正常鼠,并且对自身免疫病的易感性增加。调节性T细胞(Treg)具有低反应性与免疫抑制性两大功能,有研究结果提示诱生Treg是CD200诱导免疫耐受的机制之一[4]。

再障的主要发病机制为T细胞介导的针对骨髓造血细胞产生的自身免疫反应[5]。涂梅峰等[6]发现:SAA患者的Treg细胞数量减少,可能导致患者免疫耐受被打破。我们检测到SAA和NSAA患者T淋巴细胞上CD200的表达率均显著降低,提示作为一种负调控信号的CD200,可以下调髓系细胞活性,由于受某种原因或不明因素的影响,在再障患者体内表达明显减少,而当机体缺乏CD200时,骨髓中的髓系细胞活性增加、Th1型细胞因子增加、诱生调节性T细胞的能力减弱,使免疫耐受打破,机体对AA的易感性增加。SAA与NSAA无显著性差异,提示AA的发病有多因素参与,CD200表达异常只是参与AA发病的因素之一。

再障是Th1细胞功能亢进性疾病,Th1/Th2比例失衡,Dubey等[7]分别对正常对照和AA患者的骨髓及T淋巴细胞浆内TNF-α、IFN-γ研究发现,AA患者骨髓内两种细胞因子含明显高于正常对照组。国内学者[8]发现SAA患者血清sIL-2R水平明显高于正常对照组。我们的检测结果与国内外文献报道一致,说明AA的发病不仅与T细胞功能紊乱及其分泌的Th1型细胞因子增高有关,还与Th2型细胞减少及Th2型细胞因子相对不足有关。

相关性分析提示:由于负调控因子CD200减少,不能有效抑制T细胞介导的过度免疫应答,AA患者体内IL-2、IFN-γ等Th1型细胞因子增多,二者呈负相关。另外,CD200表达率与Th2型细胞因子水平亦成负相关,对此,我们认为,虽然由于本组AA患者T淋巴细胞上CD200明显减少,所诱导的T淋巴细胞分泌的Th2型细胞因子会相应明显减少,但机体可能通过其它途径试图上调Th2型细胞因子的分泌,提升Th2型细胞因子的血清水平,努力实现对自身抗原的免疫耐受,进一步说明AA发病机制的复杂性。

1 Nakao S,Feng X,Sugimori C.Immune pathophysiology of aplastic anemia[J].Int J Hematol,2005;82(3):196-200.

2 袁 烨,邵宗鸿.获得性再生障碍性贫血发病机制的研究进展[J].国外医学·输血及血液学分册,2006;29(3):200-203.

3 Diao J,Gorczyski RM,Cattral M.Regulatory role of CD200 on dendritic cells[J].FASEB J,2002;16(5):226-267

4 Gorczyski RM,Lee L,Boudakav I et al.Augmented induction of CD4+CD25+Treg using monoclonal antibodies to CD200R[J].Transplantation,2005;79:488-491.

5 Nakao S,Feng X,Sugimori C.Immune pathophysiology of aplastic[J].Int J Hematol,2005;82(3):196-200.

6 涂梅峰,邵宗鸿,刘 鸿 et al.重型再生障碍性贫血患者Th3细胞、调节T细胞数量和转化生长因子βl的水平[J].中华血液学杂志,2006;27(11):753-756

7 Dubey S,Shukla P,Nityanand S et al.Expressionof interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha in bone marrow T cells and their levels in bone marrow plasma in patients with aplastic anemia[J].Ann Hematol,2005;84(9):572-577.

8 程 鹏,彭志刚,宁自觉.再生障碍性贫血患者造血祖细胞及免疫机制的研究[J].西部医学,2007;19(5):778-780.