薄层色谱法测定山东观赏牡丹中丹皮酚的含量

苗方 李琳 赵训允 安 芸

(菏泽医学专科学校 山东 菏泽 274000;①山东省牡丹大药房)

牡丹皮为毛莨科芍药属植物牡丹的干燥根。本品为《中国药典》收载品种,性微寒、味苦。具有清热凉血、活血化瘀之功效[1]。牡丹皮目前正作为一种传统中药被日益重视和广泛使用。经药理研究证明,具有催眠、抗炎、镇痛、解痉等作用[2]。在日化方面,可将皮肤中沉积色素还原褐色,使皮肤增白,对色斑、肌肉痛具有较好治疗和保健效果[3]。有文献报道,用高效液相色谱法和差示分光光度法测定丹皮酚含量的报道[4]。本文用薄层色谱法结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 日本岛津 Cs-900型双波长薄层扫描仪(日本岛津);定量毛细管(日本岛津公司);薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂);AK-12A型中药粉碎机(天津市华航制药机械有限公司);超声波清洗器(上海超声波仪器厂);薄层层析用硅胶 G(青岛海洋化工厂)。丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所)供含量测定用,化学试剂均为分析纯;乙醇(天津科密欧化学试剂开发中心;分析纯)。

1.2 牡丹皮的采集方法 采收季节多在秋分和寒露之间,地上枝叶变黄枯萎时采挖。将挖出的根用力辗转,顶端使根皮一侧破裂,皮心略脱离,一手捻住不裂口的一侧,一手捏住木心,将木心顺破裂口往下边拉,边分离边剥出,除去木心后顺手把根条捻直,并撮合裂缝口,晒干,即为商品“牡丹皮”。产地:样品采集采自菏泽市牡丹种植基地,药材均为分株移植 3年的牡丹。

2 方法

2.1 样品溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备。取供试药材样品,粉碎成直径不大于 2mm的碎块,润湿 120min。精密提取 5g,置索氏提取器中,用氯仿 60mL回流提取 10h,提取液减压浓缩至小体积,用无水乙醇定容于 10mL容量瓶中,作为供试品溶液。

2.1.2 标准品溶液的制备。精密称取丹皮酚对照品 5mg,用无水乙醇定容至 10mL,作为标准品溶液。

2.1.3 缺牡丹皮空白对照液的制备。按处方比例称取除牡丹皮外的其它药材,按样品的制备工艺及样品溶液的制备方法,制得缺牡丹皮空白对照溶液10mL。

2.2 薄层层析条件 称取硅胶 G5g,用 0.3%CMC-Na液14mL在匀浆机中调和均匀后,用铺板器均匀涂铺于 20cm×20cm薄层板上,厚 0.3mm,自然干燥后在 110℃活化 1.5h,取出置干燥器内备用,将样品与对照品溶液 5点于同一薄层板上,以环己烷 -氯仿 -无水乙醇(7:3:1)溶剂系统上展开 10cm,挥干溶剂,于紫外灯 257nm下定位在薄层扫描仪上测定。

2.3 薄层扫描测定条件 扫描方式为反波长反射法,锯齿扫描:测定波 长 λs=274nm,参比波长 λR=365nm,扫描速度20mm/min反射锯齿扫描;夹缝 1.25mm×1.25mm线性参数Sx=3。

3 结果

测得观赏牡丹皮中丹皮酚含量为 1.46mg/g,加样回收率为97.60%,变异系数为 1.15%。

3.1 空白干扰试验 按含量测定条件,对点样层析后的供品、丹皮酚及缺丹皮空白液的各斑点分别在 λs=274nm,λR=365nm进行扫描,划出吸收曲线。结果表明:缺牡丹皮空白液在与丹皮酚对应位置上无明显吸收峰,基本上为平线,而标准品、供试品在相应位置上有明显的吸收峰,这表明本测定无明显干扰。

3.2 线标关系考察(标准曲线) 精密吸取标准品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL点于同一硅胶 G薄层板上,将选定的色谱条件,展开,取出晾干,置紫外灯下检识定位,扫描测定,以点样量(μg)为横坐标,峰面积分值为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明:丹皮酚在 1～1.5μg范围内,点样量与峰面积积分分值呈良好线性关系,所得数据进行处理得回归方程 Y=32316x+6080,相关系数r=0.9987表明在其范围呈现良好的线性关系,并通过原点。

3.3 稳定性试验 精密吸收丹皮酚对照品和供试品溶液于同一块薄层板上展开,挥于展开剂,立即扫描测定斑点峰面积值,每隔 0.5h扫描 1次连续 3h,结果表明:对照品和供试品斑点在测定时间 100min内斑点稳定,峰面积积分值基本不变。

3.4 精密度试验

3.4.1 同板精密度试验。准确吸收标准品溶液 4μL,供试品溶液 4μL,在同一薄层板上点 5个相同量的点,依法测定各斑点的斑面积积分值并计算精密度,结果见表 1。

表1 同板精密度实验结果

3.4.2 异板间精密度试验。准确吸取标准品溶液 4μL,供试品溶液 4μL,分别点于 5块薄层板上,每板点 5个相同量的点,依法测定并计算各板样品中丹皮酚的含量。结果见表 2。

表2 异板精密度试验结果

3.5 重现性试验 取同一批样品约5g,精密称定,共称取6份,依法测定各样品中丹皮酚的含量,结果6次测得平均值为1.165mg/g,变异系数 RSD=1.76%,表明重复性良好。

3.6 加样回收率试验 精密称取牡丹皮约 5g,分别精密加入丹皮酚对照品约 3mg,然后按照供试品溶液的制备方法,回收实验液,依法测定各实验液中丹皮酚含量,并计算回收率,结果 5次测定的平均回收率为 97.60%,变异系数为 1.15%。结果见表3。

表3 加样回收率实验结果

3.7 样品含量测定 精密吸取 3批供试品溶液各 4μL及丹皮酚标准品溶液 2、4μL点于同一薄层板上,依法展开,扫描,按外标两点法计算样品中丹皮酚含量,结果见表 4。

表4 含量测定结果

4 讨论

丹皮酚为主要有效成分且已成为衡量丹皮质量的法定标准之一。《中国药典》规定秋季采取丹皮,当地农户一般在立秋后开始采挖。至霜降前采取完毕,在春夏两季开始正是牡丹生长发育高峰期,光合作用旺盛,对丹皮的产量影响甚大,当地农户在采取牡丹根后,用竹片或其它工具刮去根的表皮(即木全皮层)抽去木心,晒干即为刮丹皮,在国内市场销售,若只抽去木心,不刮表皮,直接晒干,即为原丹皮主要供外贸出口[5]。

对牡丹皮干燥药材设计正交试验考察提取条件,考察项目为溶剂(水、乙醇、丙酮)粉碎度(切片、粗粉、中粉)提取方式(回流、超声、索氏提取)提取时间(8、10、12h)。结果表明,最佳提取时间为 95%乙醇索氏提取 10h。测量观赏牡丹皮中丹皮酚的含量,方法简便,重现性好,灵敏度高,适用于测定牡丹皮及其制剂中丹皮酚的含量。自唐代以来,牡丹广泛种植,山东省是我国观赏和药用牡丹的主产区之一。曹州菏泽栽培面积近 15万亩,观赏品种近千个,年产丹皮近百吨[6]。牡丹皮药理学研究表明[7],丹皮酚具有重要的药理作用。因此,通常以丹皮酚含量作为质量控制的主要指标[8]。张氏等[9]研究,丹皮酚含量和牡丹皮中另一有效成分芍药苷呈明显正相关。所以本实验在其它检测指标符合《中华人民共和国药典》规定时,以丹皮酚含量高低判断药材质量。为菏泽牡丹皮进入临床提供参考。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典 I部[S].北京:化学工业出版社,2000.137

[2]张 旃.丹皮酚的药理作用及机制[J].中医药信息,2006,23(2):21

[3]戴 敏,刘青云,顾承刚,等.丹皮酚对脂质过氧化反应及低密度脂蛋白氧化修饰的抑制作用[J].中国中药杂志,2000,25(10):625

[4]孙言才,沈玉先,孙国平,等.反相高效液相色谱法测定原料药及注射液中丹皮酚的含量[J].中国药理学通讯,2003,19(5):593

[5]安徽经济植物志增修编写办公室.安徽经济植物志(上册)[M].合肥:安徽科学技术出版社,1990.260-261

[6]刘 超,陈光亮,赵帜平,等.丹皮多糖对正常及高血糖小鼠的降血糖作用[J].安徽中医学院学报,1998,17(6):45

[7]庄明蕊,林 晓,崔丽华,等.牡丹皮质量评价分析[J].食品与药品,2006,8(9):56

[8]龙全江,徐雪莲,卞艳红.市售丹皮酚饮片质量分析[J].时珍国医国药,2000,11(3):197

[9]张留记,屠万倩,屈凌波,等.不同产地牡丹皮中丹皮酚和芍药苷含量的 HPLC法测定[J].信阳师范学院学报,2007,20(2):223