人骨髓间充质干细胞的体外多向分化潜能

邓方阁,李玉林

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力及多向分化潜能,在不同的诱导条件下,可向多种组织细胞分化[1-5]。目前,利用MSCs多向分化潜能及其可自体利用且无免疫排斥等特性,作为种子细胞用于组织工程学和基因工程学研究已成为热点。本研究在体外分离人骨髓血,利用密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养出人MSCs(human MSCs,hMSCs),分别利用3种不同的条件诱导培养基,诱导hMSCs向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞分化,为细胞移植、组织再生修复可能的自体来源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Percoll(Pharmacia,Biotec,USA),LDMEM,HDMEM和10%胎牛血清(均Hyclone,USA),100 U/ml青链霉素双抗 (华北制药厂),0.125%～0.250%胰酶(Promega,USA),鼠抗人单克隆抗体 CD31、CD34、CD44、CD45、CD105(Neomarker,USA),地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxan- thine,IBMX)、抗坏血酸、β2甘油磷酸钠、阿扎胞苷(5-氮杂胞苷,5-azacitidine,5-Aza)、油红O(Sigma,USA)。

1.2 人骨髓间充质干细胞的分离培养及免疫表型检测 方法同文献[6]所述,在无菌状态下取自愿捐献者的肝素化的穿刺骨髓血3～5 ml,利用Percoll(比重为1.073 g·ml-1)密度梯度离心,抽取单个核细胞层,用含青链霉素双抗(100 U/ml)的10%胎牛血清的L-DMEM 重悬细胞,计数以(3～4)×106的细胞密度接种在6孔板中进行培养。接种后3 d首次换液,每隔3～4 d换液一次。当原代细胞接近汇流(＞80%融合)时,0.25%胰酶消化传代培养,取生长状态良好的传代hMSCs用于后续研究。胰酶消化收集细胞,1×106个/mL细胞与一抗单克隆抗体 CD31 、CD34、CD44、CD45、CD105 孵育液常温下孵育30～40 min。PBS洗涤2次后与FITC标记的二抗4℃避光孵育20～30 min。PBS冲洗2次后加500 μ l PBS重悬细胞,用于流式细胞仪分析。

1.3 人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞的诱导分化 取生长状态良好的传代hMSCs,以2×105个/cm2密度接种于置有处理过的盖玻片的24孔板中,当细胞融合达到60%～70%时,更换为成骨诱导培养基(地塞米松1μ mol/L,β2甘油磷酸钠 10 mmol/L,抗坏血酸 50 μ mol/L)、成脂诱导培养基(地塞米松1 μ mol/L,吲哚美辛0.2 mmol/L,胰岛素10 mg/L,IBMX 0.5 mmol/L),每隔3 d更换培养液1次,继续诱导14 d后固定细胞,进行碱性磷酸酶染色检测或油红O染色检测。

1.4 人骨髓间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化取生长状态良好的传代hMSCs以2×105个/cm2密度接种于置有处理过的盖玻片的24孔板中,当细胞融合达到 60%～70%时,更换成 1%FBS的HDMEM饥饿培养24 h,后换成心肌细胞诱导培养基(5-Aza,10 μ mol/L)孵育 24 h,再换成不含诱导剂的培养基继续培养14 d,细胞固定,进行PTAH染色。

2 结 果

2.1 人骨髓间充质干细胞的形态学特征及免疫表型 接种的骨髓单个核细胞,3 d后逐渐贴壁生长,经2～3次完全换液后,贴壁生长的细胞形态均一,呈长梭形。培养至10～18 d,细胞出现80%～90%的融合。传代后的hMSCs形态上更加趋于一致,均为紧密排列的成纤维细胞样细胞(图1)。流式细胞检测表明,hMSCs表达CD44、CD105,不表达血管内皮细胞标志CD31、造血干细胞标志CD34和白细胞表面抗原CD45。表型检测参见前期实验论文[5]。

图1 传代后的hMSCs(HE ×200)

2.2 多向分化潜能的鉴定

2.2.1 成骨诱导 细胞在成骨诱导体系中培养4～5 d,细胞形态发生明显改变,细胞由原来的成纤维细胞样变为多角形,诱导1周,80%以上的细胞为不规则形,诱导2周,细胞间相互融合,并形成散在的细胞结节。碱性磷酸酶染色显示,聚集成的结节区呈棕黑色,表明此结节为钙盐沉积(图2)。

图2 hMSCs分化为成骨细胞(碱性磷酸酶染色 ×250)

2.2.2 成脂肪诱导 hMSCs在成脂肪诱导体系中培养3d,细胞内出现微小脂滴,细胞形态也逐渐由成纤维样细胞变为胞体增宽的短梭形、圆形或多角形,培养2周时,细胞内的脂滴增大,并相互融合。油红O染色显示,细胞内脂质沉积,脂滴被特染成红色,与油红O染色阳性对照的人脂肪细胞相似,表明成脂分化的hMSCs在细胞化学特性上已具有与人脂肪细胞相似的细胞化学特性(图3)。

图3 hMSCs分化为脂肪细胞(油红O染色 ×200)

2.2.3 成心肌诱导 细胞经5-Aza诱导1周,细胞变化并不明显,部分细胞变长或变宽大;诱导2周,细胞逐渐由长梭型变成多爪型或星型。PTAH染色显示,经5-Aza诱导后的细胞,胞浆呈蓝色。通过与SD乳鼠心肌细胞 PTAH染色相比较,提示成心肌细胞分化的hMSCs在细胞化学特性上具有与 SD乳鼠心肌细胞相似的细胞化学特性(图 4)。

3 讨 论

组织器官移植可能是人类攻克某些重大疾患如心脑血管疾病、癌症、老年性疾病等的根本措施。正因为这些取自人胚胎或骨髓的具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体的干细胞,可用于培育不同的人体细胞、组织或器官,有望成为移植器官的新来源。但是,由于胚胎干细胞在伦理道德等方面的制约而备受争议,因此骨髓来源的干细胞越来越受到广泛关注。

图4 成心肌诱导后的hMSCs分化为心肌细胞(PTAH染色 ×200)

目前,普遍认为,在骨髓中至少存在两种干细胞群,即造血干细胞和MSCs。MSCs是中胚层发育的早期细胞,可通过体外贴壁培养加以分离,不仅能分化为造血实质和基质细胞等,还分化为多种造血以外的组织,特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞[1-5]。随着干细胞工程及其相关生物技术研究发展,以及对干细胞本身特有的特性认识,使得研究者在体外培养动物MSCs,体外定向诱导分化为所需的不同细胞,同时体内动物实验也已成功证实MSCs的修复作用,如在鼠的慢性肢体缺血模型中,MSCs参与血管形成,表达内皮细胞及平滑肌细胞标志[7];将MSCs移植入鼠的心肌梗死区,可分化成心肌细胞,充填梗死病灶,并与心肌细胞形成缝隙连接,诱导血管新生,从而形成了有功能的心肌组织[8-9];将体外扩增的MSCs装入扩散小室(多孔陶瓷或陶瓷柱)后再移植入动物体内,扩散小室内的MSCs能够利用宿主动物体内的营养合成骨和软骨[10];将建系的鼠胚胎干细胞[11]或少量部分分化的胚胎干细胞形成的胚体细胞[12]植入帕金森病小鼠,可分化为多巴胺神经元。从理论上来说,由于使用的是来自患者自身组织培养扩增的治疗用细胞,因此移植时患者体内不会产生免疫排斥反应。此外,干细胞可无限高度增殖,在数量上以保证治疗的需要,从而解决了可供移植细胞、组织或器官严重不足的问题。随着整体社会的老年化,每年都有数以百计的患者需要进行修复或移植,干细胞工程及其相关生物技术研究将可能解决这些问题,为人类的健康与长寿带来新的希望。

迄今为止,尚未发现MSCs的特异性表面标志[2-3],因而缺乏直接的鉴定方法。目前判断体外培养的MSCs主要采用联合鉴定方法[1-4]:(1)体外分离培养的细胞形态为均一的梭形、纺锤状或成纤维细胞样的细胞;(2)SH2(CD105)、CD44等呈阳性表达,而CD31、CD34、CD45等呈阴性表达;(3)在不同诱导条件下可向多系定向分化。多向分化潜能和自我更新是干细胞的基本特点。因此,在本研究中,利用密度梯度离心及贴壁筛选法分离人骨髓血,培养出形态为成纤维样、梭形的细胞;经免疫细胞化学检测,表达CD44和CD105,不表达造血干细胞标志CD34和白细胞表面抗原CD45。经不同的诱导条件培养基诱导,可分别分化成成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞。上述的实验结果完全符合目前所定义的体外培养的MSCs主要采用联合鉴定方法,从而证实人骨髓中的MSCs易于体外分离培养,且具有多向分化潜能,在不同的诱导体系下能分化成不同类型的组织细胞,可为骨组织工程学、心肌组织再生医学中损伤组织的修复与治疗提供自体来源细胞。

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