淋巴管内皮细胞与PGA的相容性研究

戴婷婷 蒋朝华 周广东 刘伟 李圣利

组织工程技术构建淋巴管的关键是要形成淋巴管内皮细胞（Lymphatic endothelial cells，LEC）与生物支架的三维复合体。目前，组织工程研究中，应用较多的可降解人工合成材料是聚羟基乙酸（Polyglycolic acids，PGA）。该材料可加工成直径 15 μm 的纤维，具有以下特点：能形成稳定的三维空间结构；具有较好的生物相容性；通过调整分子量大小，可以控制降解速度；其体内最终降解产物为CO2和水，对机体无毒副作用。作为一种生物相容性良好的人工合成生物材料，PGA已在软骨、骨和肌腱等组织工程的临床研究中显示出巨大的优势和应用潜力[1-3]。

本实验选用PGA作为人LEC黏附生长的支架，研究LEC与PGA的生物相容性，探讨PGA支架应用于组织工程化淋巴管构建的可能性

1 材料和方法

1.1 生物支架PGA的制备

取直径为15 μm，重量为60 mg的PGA纤维（ALBANY公司），制成20 mm×15 mm×1 mm的薄片，75%乙醇浸泡1 h后，PBS反复冲洗3次，吸干水分后，紫外灯照射30 min消毒备用。

1.2 LEC的分离、培养

取幼儿包皮环切术后废弃的包皮，2块为一组，反复清洗，去除皮下疏松结缔组织，采用中性蛋白酶（Roche 公司）结合胶原酶（Gibco 公司）消化，CD34阴性分选和CD31阳性磁珠（Dynal公司）分选，获得CD34－/CD31＋细胞[4-6]。用完全内皮细胞培养基（EGM-2-MV）（Lonza公司）重悬细胞，计数，调整细胞浓度至1×105cells/mL后，接种于用20 ng/mL纤维连接蛋白（Sigma公司）铺底的6孔板中培养。3～4 d换液1次。细胞生长到90%融合后，以0.05%胰蛋白酶消化，1∶3～4传代于6孔板中 （无需纤维连接蛋白铺盘）。用于制作细胞爬片的玻片也需预先用20 ng/mL纤维连接蛋白处理。

1.3 细胞免疫荧光鉴定[7-9]

CD34－/CD31＋细胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，分别滴加鼠抗人Podoplanin抗体（1∶100）和 VEGFR-3 抗体（1∶100），37 ℃孵育30 min；PBS漂洗3次，滴加FITC荧光二抗，37℃孵育30 min；PBS漂洗3次，蒸馏水漂洗3次，荧光显微镜观察。

1.4 细胞与PGA支架复合物的体外培养

消化、离心第4代LEC，将细胞浓度浓度至1×107cells/mL，制成细胞悬液，接种到PGA支架上，置 37℃、5%CO2细胞培养箱中，4 h后加 10 mL EGM-2培养液，培养7 d，每隔2天换液一次。

1.5 扫描电镜观察

取培养1周的LEC-PGA复合物，PBS洗涤，2.5%戊二醛固定，系列脱水，乙腈置换，真空干燥，表面喷金后行扫描电镜观察并摄像。

1.6 RT-PCR检测

取培养1周的LEC-PGA复合物，TRIzol法行RNA 抽提。 RT：20 μL 反应体系，25 mmol/L MgCl24 μL，10×逆转录缓冲液 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，40 U/L RNase抑制剂 0.5 μL，5 U/L AMV 逆转录酶1 μL，200 ng／I～LOligo dT-Adaptor Primer 1 μL，RNA 2 μg，加无 RNase 水至 20 μL；反应条件为 30℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。PCR：引物序列包括人Prox上游引物5-CTCATAAAGTCCGAGTGCG-3， 下 游 引 物 5－AACATCTTTGCCTGCGATA-3；人Podoplanin上游引物5-GTGTAACAGGCATTCGCATCG-3，下游引物5-GGCAAGTGTTCCACGGGTC-3；人LYVE-1上游引物5-GTTTCTTTCATGCTCCTTACCC-3，下游引物5－GTCTCAGTGACTCCTTGGCTTT-3； 人 VEGFR-3上游引物5-AGAGGAACCAGGAGGACAAG-3，下游引物 5-CAGGTGCTGAAGGGACATT-3。 20 μL 反应体系：ddH2O 13.8 μL，25 mmol／L MgC121.6 μL，10×逆转录缓冲液 2 μL，10 mmol／L dNTP 0.5 μL，5 U/L Taq 酶 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，20 pmo～L 目的基因上下游引物各0.3 μL。反应条件：95℃变性5 min；95℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s， 共 35 个循环；72 ℃延伸10 min。电泳图像分析：PCR产物 20 μL经1.2%琼脂糖、70 V电压电泳1.5 h后，进行图像分析。

2 结果

2.1 LEC的鉴定

酶消化结合免疫磁珠分选法获取的LEC，纯度高，呈内皮细胞典型的铺路石样排列（图1）；细胞免疫荧光检测显示，CD34－/CD31＋细胞呈现LEC特异性标志Podoplanin和VEGFR-3（图2）。

图1 单层培养的LEC呈典型的铺路石样排列（40×）

图2 细胞免疫荧光染色

2.2 LEC-PGA复合物扫描电镜观察

复合物体外培养3 d时，可见单个LEC呈类圆形，较扁平，细胞在与PGA接触部位伸出细小伪足，黏附于PGA纤维；体外培养1周后，可见细胞分泌大量细胞外基质（图3）。

图3 LEC-PGA扫描电镜观察

2.3 RT-PCR

琼脂糖凝胶电泳显示，构建产物能特异性表达LYVE-1 mRNA、Podoplanin mRNA、Prox-1 mRNA和 VEGFR-3 mRNA（图 4）。

图4 RT-PCR检测LEC特异性表型

3 讨论

淋巴系统阻塞性疾病的治疗，迄今仍然是临床的难题[10]。通过显微淋巴外科技术吻合淋巴管，实现淋巴回流的重建，是目前治疗阻塞性淋巴水肿的有效手段。但淋巴管移植材料缺乏，自身淋巴管移植后易引起供区水肿。组织工程技术的发展为上述难题的解决提供了新的思路[11-12]。

淋巴管内皮细胞层是执行淋巴管生理功能的重要物质基础。因此，获取足够量的健康、有活力的种子细胞是构建淋巴管内皮层的首要问题。我们从幼儿包皮组织中获取大量的LEC[5-6]，同时还证实了冻存的内皮细胞复苏后无明显形态学改变，并保持了较高的活力及体外增殖能力[13]。此方法获得的LEC经过鉴定，不仅纯度高，而且表型可以维持10代以上。我们采用第4代细胞接种材料，细胞状态成熟稳定，增值能力强，接种时将其调整到合适的细胞浓度（5×107cells/mL），使其达到与PGA支架复合的最佳条件。PGA纤维为细胞生长、迁移、分化和细胞外基质的分泌提供了条件，同时伴随着自身的降解，引导新生的组织按照支架模型的三维结构生长。PGA是典型的合成可降解聚合物，降解后生成羟基乙酸。由于羟基乙酸是体内三羧酸循环的中间代谢物，且吸收和代谢机理已经明确，并具有可靠的生物安全性，已被美国FDA批准用于临床，广泛用于组织工程化软骨、骨、肌腱和皮肤等的研究。Niklason等[14]以PGA为支架材料，成功构建了组织工程化血管。

本实验首次选用PGA作为支架材料，进行LEC-PGA复合物体外培养研究。结果表明：淋巴管内皮细胞可在PGA形成的三维空间结构中生长并分泌基质，维持其表型不变；PGA对细胞生长无明显不良影响。综上所述，可以认为PGA是构建组织工程化淋巴管内皮层的合适材料。我们将在此基础上，进一步开展构建含平滑肌层与内皮层的组织工程化淋巴管的研究。

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