重症监护病房医院感染铜绿假单胞菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型

庞杏林, 陈守义, 邓志爱, 张欣强, 李孝权, 胡玉山

铜绿假单胞菌(Pseudomonas areuginosa,Pa)是临床上最常见的一种引起医院感染的条件致病菌,由Pa引起的医院感染发生率＞30%[1]。Pa对多种抗生素往往存在天然耐药性,由该菌引起的医院感染的流行已受到广泛关注。近年来随着细菌分子分型方法的发展,监测和控制医院感染的水平有了很大的提高,脉冲场凝胶电泳(PFGE)就是其中的一种细菌分子分型技术,PFGE被认为是目前细菌分子流行病学研究“金标准”,是公认的医院感染调查最好的分型方法[2]。本研究对ICU中分离的14株Pa菌株进行PFGE分型及耐药性分析,以确定Pa菌株的克隆构成,了解ICU中Pa感染的分子流行病学特征。

材料与方法

一 、材料

(一)实验菌株 14株Pa分离自 2008年5—6月广州市某三级甲等医院ICU,临床诊断为医院获得性肺炎患者的下呼吸道标本[3]。标准菌株为Pa ATCC27853。

(二)主要试剂与仪器 培养基为广州迪景公司商品,采用法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动微生物鉴定仪、VIT EK GNI细菌鉴定卡和英国OXOID公司10种药敏纸片。SPeI酶为TaKaRa公司产品,蛋白酶K为Merck公司产品,脉冲场电泳仪及Gel Dos XR成像系统均为美国Bio-Rad公司产品。

二 、方法

(一)细菌鉴定与药敏试验 细菌分离、培养、鉴定和药敏试验均严格按照《全国临床检验操作规程》(第3版)进行。采用VITEK-2全自动微生物鉴定仪作细菌鉴定,10种抗菌药物药敏试验采用纸片扩散法(K-B法),以Pa ATCC27853作质控株。以CLSI M100-S17版的标准判读药敏结果[4]。

(二)PFGE 将Pa菌株均匀洗脱于 200 μ L细胞悬浮液中,菌液浓度调为1.0麦氏单位,用蛋白酶K进行消化,低熔点琼脂糖凝胶包埋消化过的Pa,倒入模具制成胶块,切取4 mm×4 mm大小的胶块加入限制性内切酶SPe I 30 u,在37℃水浴中酶切过夜。酶切胶块进行1%低熔点琼脂糖凝胶电泳,电泳参数为电压6 V/cm,夹角120°,温度14 ℃,第1阶段脉冲时间5～15 s,电泳时间9 h,第2阶段脉冲时间15～50 s,电泳时间9 h。用沙门菌H9812作为分子量对照。电泳完毕后胶块用1 mg/L的EB染液染色30 min,超纯水漂洗2次,每次 20 min。胶块置成像仪阅读结果,使用BioNumerics version 4.0软件,选择Dice相关系数和UPGMA方法进行PFGE结果处理和聚类分析。

结 果

一、PFGE分型结果

14株Pa菌株PFGE指纹图见图1,Pa菌株的全基因组DNA经过SPe I酶切后,通过PFGE分析产生18～27个条带,条带分子量大小范围20～1 200 kb。14株Pa菌株PFGE电泳聚类分析结果见图2,PFGE电泳条带相似度在76%～100%,根据相似度100%者视为同型株,可将14株Pa分6个型别,命名为A 、B、C、D 、E 和F型 。其中 A 型为优势菌株共8株(57.1%),B型2株(14.3%),其余型别各有1株(分别占7.1%)。

二、药敏试验结果

14株Pa药敏试验结果见表1。Pa对10种抗菌药物产生不同程度的耐药性。根据药敏试验结果分析发现分子A型Pa可产生2种耐药表型,有5株A型Pa产生相同的耐药表型,对10种抗菌药物100%耐药,其余3株A型Pa对头孢他啶、阿米卡星和氨曲南3种抗生素敏感,对其他7种抗菌药物耐药。2株B型Pa中除了1株对环丙沙星产生耐药外,其余均为敏感。C型Pa对环丙沙星耐药,D型和E型Pa对妥布霉素耐药,F型Pa对10种抗菌药物均敏感。患者平均住院时间为67 d,平均年龄74岁,基础疾病为慢性阻塞性肺疾病(COPD),治疗期间接受过气管插管或呼吸机人工通气及电动吸痰等有创性治疗措施,有激素治疗史,而且均有第三代或第四代头孢菌素及亚胺培南等抗生素用药史。Pa耐药表型与临床资料见表2。

表1 14株Pa的药敏结果Table 1.Susceptibility of 14 Pseudomonas aeruginosa strains to antimicrobial agents

表2 14株铜绿假单胞菌耐药表型与临床资料Table2.Baseline clinical data and susceptibility of 14 Pseudomonasaeruginosa strains to antimicrobial agents

讨 论

Pa广泛存在于自然界,可定植于人体的皮肤、呼吸道、肠道和尿道,是一种重要的条件致病菌,对多种抗生素天然耐药。随着抗生素广泛使用,Pa已成为医院获得性肺炎最常见的病原菌。来自国内外的研究均显示：Pa是医院获得性感染的最主要的病原菌之一[5-6]。在ICU中Pa的感染容易以暴发形式发生,暴发流行往往是由同一克隆株,通过某种传播途径,在同一病区内引起不同患者的交叉感染。本次研究在ICU临床分离的14株Pa菌株中有8株同为PFGE分型A型菌株,具同源性,应视为暴发流行株。分析结果表明在相近的时间段内,曾经存在着某种途径引起该菌株在ICU患者之间的克隆传播。追溯病史可以发现患者平均住院时间为67 d,平均年龄74岁,均存在较严重的基础疾病以及各种合并症,治疗期间都接受过气管插管、呼吸机人工通气及电动吸痰等有创伤性治疗措施,有激素治疗史,而且均有第三代或第四代头孢菌素及亚胺培南等抗生素用药史。说明ICU中容易发生Pa引起的医院感染是与老龄患者、住院周期长、免疫功能低下、大量抗生素使用和激素治疗、使用各种侵袭性操作等因素相关。宿主防御能力受损的重症患者罹患Pa感染的危险较大。

本研究资料显示,Pa对常用于治疗产ESBLs菌感染的亚胺培南 35.7%耐药,与文献报道相符[7]。亚胺培南属于碳青霉烯类抗生素,由于该药抗菌谱广,对产ESBLs和AmpC的细菌具有良好的抗菌活性,而被认为是治疗多重耐药细菌的理想药物。但是,近年来亚胺培南在临床上广泛应用,其耐药率也逐年增加,Pa对亚胺培南耐药性尤为明显[7]。本研究14株Pa中5株(35.7%)对亚胺培南耐药。Pa对亚胺培南产生耐药与产生IMP、VIM、SPM、GIM型金属β内酰胺酶、GES-2型β内酰胺酶和外膜蛋白oprD2缺失相关[8]。其他机制尚有靶位结构改变、生物膜的形成等[9]。加强对碳青霉烯类抗生素的耐药性检测及耐药机制的研究,指导临床合理应用该类抗生素,延缓其耐药性的发展。阿米卡星也是临床治疗Pa使用的一线药物,但资料显示Pa对阿米卡星的耐药率为35.7%,相关文献报道可高达56%[10]。这也说明,对于产酶和泛耐药的Pa临床应该选用何种抗生素予以治疗已是一大难题,而抗生素的规范使用是避免细菌产生耐药性的首要原则。

国内外至今没有建立标准的Pa菌PFGE实验程序,本研究拟探索和优化PFGE应用于Pa分型的实验条件,建立本实验室的Pa菌PFGE实验程序。与文献对比[11-12],发现一些不同之处,如在Pa最佳菌液浓度的调整上,分别用了3种菌液浓度：0.5、1.0和2.0麦氏单位,结果表明1.0麦氏单位的菌液浓度时DNA电泳条带最佳,由此说明,菌量的过多、过少都会影响电泳条带的清晰度。限制性内切酶的选用在PFGE中是至关重要的,本研究中分别选用了Xba I和Spe I 2种限制性内切酶进行酶切,Spe I酶切条带相对较多,酶切效果较理想。电泳时间上比较了16、18和20 h的电泳效果,16 h电泳时间过短,没有充分分开酶切条带的电泳距离,可辨性低,而20 h电泳时间过长,小于50 kb的酶切片段电泳于凝胶外,18 h电泳时间既保留了所有DNA酶切片段又可以有效分辨DNA条带的距离,所以确定18 h为最合适的电泳时间。实验证明,本研究选择的PFGE方法和条件是适宜的,具有较好的分型性、分辨力和重复性,是理想的细菌分型方法,能准确地反映病原的流行病学相关性。

[1] Stove CK,Pham QX,Erwin AL,et al.Complete genome sequence of Psedomonas aemginosa PAOI an opportunistic Pathogen[J].Nature,2000,406(6799)：959-964.

[2] Maslow JN,Mulligan ME,A rbeit RD.Molecular epidemiology：application of contemporary techniques to the typing of microorganisms[J].Clin Infect Dis,1993,17(2)：153-162.

[3] 中华医学会呼吸病学分会,医院获得性肺炎诊断和治疗指南(草案)[J].中华结核和呼吸感染杂志,1999,22(4)：201-203.

[4] Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.Sixteenth informational supplement[S].2007,M100-S16.

[5] 王辉,陈民均.1994～2001年中国重症监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁[J].中华医学杂志,2003,83(5)：385-390.

[6] Vincent JL,Bihari DJ,Suter PM,et al.The prevalence of nosocomial infection in intensive care units in Europe.Results of the European Prevalence of Infection in Intensive Care(EPIC)study[J].JAMA,1995,274(8)：639-644.

[7] 骆俊,朱德妹.铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2008,8(1)：76-79.

[8] 许宏涛,陈东科,俞云松,等.多重耐药铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶耐药机制研究[J].中华医院感染学杂志,2005,15(1)：20-22.

[9] Gerald LM,John EB,Raphael D,et al.Principles and practice of infectious diseases[M].2005：2310-2335.

[10] 王福党,王亚强,颜平.70例铜绿假单胞菌产酶与耐药性的检测[J].现代预防医学,2008,35(8)：1535-1537.

[11] 黎毅敏,黄红川,刘晓青,等.重症监护病房铜绿假单胞菌医院获得性感染暴发的流行病学调查[J].中国呼吸与危重监护杂志,2006,5(6)：413-417.

[12] Speijer H,Savelkoul PH,Bonten MJ,et al.Application of different genotyping methods for Pseudomonas aeruginosa in a seting of endemicity in an intensive care unit[J].J Clin Microbiol,1999,37(11)：3654-3659.