流体剪切力对 M *C3T3-E1细胞 O PG、RANKL蛋白表达的实验研究

张 超 夏亚一 李 鹏 何万庆 王海明 汪 静 王翠芳

(兰州大学第二医院骨科研究所,兰州 730030)

自 1997年发现骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和细胞核因子 κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)后,大量的研究结果显示 OPG与 RANKL的平衡直接影响着骨组织代谢[1,2]。RANKL是一种膜结合蛋白,它可以和前破骨细胞上的细胞核因子κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)结合从而激活前破骨细胞[3],使其分化为破骨细胞,故也称为破骨细胞分化因子(osteoclastdifferentiation factor,ODF),在骨质形成和吸收中发挥作用。间质和成骨细胞都可表达OPG,它是RANK的一种竞争性抑制剂[4],OPG与RANKL结合不但阻止骨组织的吸收,而且减少了破骨细胞的产生。因此,深入探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下 OPG和 RANKL的蛋白表达机制是很有必要的。以往的研究证实,应力刺激可以影响成骨细胞中前列腺素 E2(PGE2)、雌激素、TNF、IL、等因子的表达[5～7],这些因子又分别通过不同的途径对 OPG和 RANKL的表达产生影响,进而调节骨组织的代谢。本实验通过研究处于骨组织代谢中心环节的两种分子 OPG和 RANKL在不同时段的流体剪切力作用下蛋白表达的变化,探讨流体剪切力对促进骨组织形成和抑制骨组织吸收的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

将小鼠胚胎细胞系 MC3T3-E1细胞植入无菌细胞培养瓶中,瓶中加入含有 10%胎牛血清和 100 U/ml青霉素、链霉素的培养基,放入温度 37℃、CO2饱和度 5%的孵育箱中培养,细胞每隔 3天换液一次。同时观察细胞形态和生长状态,当细胞生长面积达到瓶底面积的 80%时,用 0.25%胰酶 -0.1%Ⅱ型胶原酶消化,按照 5×105个细胞接种于无菌培养瓶中,取第三代稳定的传代细胞用于应力加载实验。

1.2 应力加载装置

应力加载系统由蠕动泵、硅胶导管、流体小室、储液管组成。储液管、硅胶导管和流体小室形成了一个闭合的回路,用蠕动泵挤压使得液体流动。其中流体小室由两块透明的有机玻璃组成,上方的有机玻璃前端和后端分别有进液口和出液口通过硅胶导管与储液管相连,下方的有机玻璃板中间凿有载玻片大小的凹槽,以便载玻片全部卡入凹槽,使细胞受到流体剪切力作用。流体小室的尺寸设计基于Poiseuille流动腔模型[8],置入盖玻片的凹槽长5cm,宽 2.5cm,高 0.2mm。该凹槽的大小满足长、宽远远大于高,长/高远远大于 10,能够保证液体流过时层流、二维流动充分发展为标准的液流,使得实验细胞均匀受力。流室底面剪切力计算公式是：τ=6ηQ/H2×W。η：流体液的黏滞系数(dyn/cm2);Q：单位时间内流经流体小室的液量(cm2/s);H：流室高度(cm);W：流室宽度(cm)。

1.3 细胞爬片加力

对状态良好的 MC3T3-E1细胞进行消化,按照1×106个细胞均匀接种到放有盖玻片(用Ⅰ型鼠尾胶原包被,以便细胞爬片)的无菌培养皿中,每次传4个培养皿,每个皿中放入3张盖玻片(10张进行实验,即 OPG和 RANKL实验组各 5张,分别加载 0,30,60,90,120min的流体剪切力;另外 2张作为备用),然后将培养皿置于 CO2培养箱中继续培养,待细胞均匀爬满盖玻片,以备加力时使用。将灭菌后的加力装置连接好放入37℃恒温箱内,储液管中加入 40 ml培养基作为流体液。在无菌条件下,迅速取出爬满细胞的盖玻片,细胞面向上嵌入流体小室下层的凹槽中,启动精密蠕动泵提供 12 dyn/cm2的流体剪切力对细胞进行加力,加力装置连接 5%CO2以维持流体液 pH值在 7.2～7.4之间。

1.4 免疫荧光实验

将完成加力后的盖玻片放入准备好的培养皿中,用 0.01%磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗 10 min,吸出洗液加入 4%多聚甲醛固定细胞,室温孵育 10min,弃多聚甲醛后 PBS冲洗 3次,每次 5 min,加入 0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)透化去交联 5min,弃 TritonX-100后 PBS冲洗 10min,加入 1%牛血清白蛋白封闭非特异性位点 30min,PBS冲洗 10min,弃液。每张爬片滴加 30μl稀释好的一抗(1∶100),放入湿盒 4℃冰箱孵育过夜。次日,PBS冲洗 3次,每次 10 min,避光条件下加入 30μl稀释好的二抗(1∶150),室温孵育 30min,PBS冲洗 3次,每次 10 min,封片后荧光显微镜下镜检每张玻片选 2个不同的视野拍照。以上实验重复 3次,用 IPP软件分析各水平蛋白表达的累积光密度值。

1.5 蛋白印迹实验

将完成加力的盖玻片迅速放入冰盒内,PBS冲洗 2次,加入细胞裂解液进行裂解,所得的产物即为总蛋白,运用 Bradford法可以测定各加力水平细胞的总蛋白浓度,将样本以相同的蛋白量加入电泳槽中,选择 6%(分离胶)和 12%(浓缩胶)的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜,转膜后用 PBS漂洗 30 min,5%脱脂奶粉封闭 2 h后,再次洗膜 30 min,加入一抗(1∶500)4℃冰箱孵育过夜。次日,再次洗膜 30 min,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(1∶1000),室温下孵育 60 min,暗室中细胞外基质(ECM)显色液显影,X光胶片曝光。以上实验重复 3次,IPP软件分析各水平蛋白表达的累积光密度值。

1.6 软件分析

2 结果

2.1 OPG和 RANKL的蛋白表达

运用 12 dyn/cm2的流体剪切力对 MC3T3-E1细胞分别加载 0,30,60,90,120min后,荧光显微镜下观察 OPG和 RANKL不同时间段的表达情况(图1)。运用积分光密度值对不同时间段 OPG和RANKL在细胞内的表达情况进行半定量分析。结果显示：FSS作用 30,60,90,120min后能够显著增加 OPG的蛋白表达(P＜0.05),图1中随着加力时间的延长,OPG荧光亮度增加,这表明 OPG的蛋白表达相应增加;同时 FSS也可以减少 RANKL的蛋白表达,但是该作用没有 OPG的变化显著,图1中随着加力时间的延长,RANKL荧光亮度降低,这表明 RANKL的蛋白表达相应减少。两者共同作用,随着加力时间的延长,OPG/RANKL值显著增高(P＜0.05)。具体数据见表1。

图1 OPG和 RANKL在 FSS作用不同时间后免疫荧光表达(×40)

表1 FSS作用不同时间 OPG和RANKL的积分光密度值(免疫荧光)(±s,n=30)

4个实验组 OPG、RANKL、OPG/RANKL与对照组两两比较,均 P=0.000

组别 OPG RANKL OPG/RANKL对照组：0min组 11512.564±131.552 15765.541±97.360 0.730±0.143实验组：30min组 12350.230±109.356 14586.032±124.183 0.847±0.205 60min组 15583.867±86.423 13662.115±103.854 1.141±0.135 90min组 18436.716±162.928 12974.861±79.481 1.421±0.197 120min组 19155.357±138.721 12539.857±117.587 1.512±0.151 F值P值99.852 0.000 25.149 0.000 62.288 0.000

2.2 OPG及 RANKL蛋白印迹结果

运用 12 dyn/cm2的流体剪切力对 MC3T3-E1细胞分别加载 0,30,60,90,120 min后,采用 Western blotting方法研究 OPG和 RANKL在不同时间段的表达情况(图2)。通过积分光密度值对不同时间段OPG和 RANKL在细胞内的表达情况进行定量分析。结果表明：FSS作用30min后,OPG的表达开始增加,当作用 60 min后,OPG的增长趋势到达高峰,与 0 min相比增加了 50%左右,而后增长趋势有所减慢,但各组之间增加显著(P＜0.05);同时 FSS也可以减少 RANKL的表达,这一作用在 90 min时达到高峰,与 0min相比减少了 30%左右,但 RANKL的变化趋势相对较缓。两者共同作用,随着加力时间的延长,OPG/RANKL值显著增高。具体数据见表2。

3 讨论

应力包括基底牵张力、流体剪切力和压应力等,骨细胞所能感受到的应力强度为 8～30 dyn/cm2[9,10]。尽管骨组织特殊的腔隙——小管网络结构决定了流体剪切力对骨组织的特殊作用[11],但是有关流体剪切力作用下成骨细胞所做出应答的研究却较少。本实验通过调节蠕动泵的转数将流体剪切力控制在 12 dyn/cm2对 MC3T3-E1细胞中 OPG和 RANKL的蛋白表达进行了研究,因为 OPG和RANKL的表达直接影响着成骨细胞和破骨细胞的功能,进而影响着骨组织形成与代谢的动态平衡,因此将 OPG/RANKL的比值作为量化成骨活性的标准,从而揭示流体剪切力对骨组织代谢的调节作用。

图2 OPG和 RANKL在 FSS作用不同时间后蛋白印迹表达

表2 FSS作用不同时间 OPG和RANKL的积分光密度值(蛋白印迹)(±s,n=30)

表2 FSS作用不同时间 OPG和RANKL的积分光密度值(蛋白印迹)(±s,n=30)

各实验组与对照组两两比较,OPG 0min vs 30min P=0.011,RANKL 0min vs 30min P=0.007,其余均 P=0.000

组别 OPG累积光密度值 RANKL累积光密度值 OPG/RANKL对照组：0min组 1356.522±35.764 4596.614±58.260 0.293±0.142实验组：30min组 1840.176±48.358 3673.850±42.873 0.506±0.131 60min组 3245.201±41.701 2407.621±49.337 1.335±0.165 90min组 4022.183±59.235 2086.316±37.641 1.940±0.170 120min组 4470.967±51.639 1782.365±31.353 2.511±0.149 F值 109.757 51.297 76.173 P值 0.000 0.000 0.012

Tyrovola等[12]证实 RANKL可以与前破骨细胞上的 RANK结合从而激活前破骨细胞,使其分化为破骨细胞,使得骨组织向着加速吸收的方向发展。而 OPG是 RANK的一种竞争性抑制剂,OPG与RANKL结合不但阻止骨组织的吸收,而且减少了破骨细胞的产生。本实验中,空白组(0min)细胞处于静态培养状态下,OPG的表达较少,相应的 RANKL的蛋白表达则较为丰富。随着培养时间的延长,RANKL的表达继续增加,这导致 OPG/RANKL的比值降低,RANKL的增多可以促进破骨细胞的形成,使骨组织代谢向着加快吸收的方向发展,这也许可以说明长期卧床缺乏运动的病人由于应力对骨骼的刺激减少,使得 OPG的表达减少,相反 RANKL的表达增加,破骨细胞形成增多,最终导致骨质疏松的发生。

成骨细胞对 FSS的响应要经历一个短暂的潜伏期,但 FSS的作用较显著。加力 30min后,阻滞了OPG/RANKL变小的趋势,蛋白检测提示 FSS促进了 OPG的表达,抑制了 RANKL的表达,二者的协同作用使 OPG/RANKL的比值较 0 min组有所增加,但这种增加较轻微,可能是 FSS对 MC3T3-E1细胞的作用要经历一个短暂的潜伏期。尽管 Rubin等[13]运用基底形变给小鼠骨细胞加力也使得OPG/RANKL的比值增加,但是与基底牵张力只减少RANKL的量相比,本实验中 FSS一方面增加 OPG的表达,另一方面还减少 RANKL的表达,使OPG/PANKL的比值增加更显著。

骨骼细胞对流体剪切力作用更加敏感且有效。加力 60min后,OPG/RANKL的比值增长最为显著。在这一时期,FSS进一步促进了 OPG的表达,相反RANKL的蛋白表达则被抑制。FSS在促进成骨细胞产生的同时也抑制了破骨细胞的形成和活化,从而抑制了骨组织的吸收,使得骨组织向着成骨的方向发展。Wang等[14]用基底牵张力给成骨细胞加力,需要 6～12 h的连续作用才能有效,而 FSS的作用在 60min后就显示出同样的效果,这说明成骨细胞对 FSS响应更快。各种形式的应力最终以牵拉和剪切的形式作用于骨骼细胞,其中又以 FSS作用最为重要。刘易军等[15]证实,FSS可以在很短时间内增加细胞内钙离子的水平,可在数十分钟内增加前列腺素的产量,而前列腺素可以在短时间内导致RANKL表达减少,同时使 OPG表达增加。这也与我们的研究不谋而合,加力60min后OPG的表达增加最大,RANKL减少最多,OPG/RANKL增加最显著。同时,Kanzaki等[16]运用挤压力对牙周膜细胞进行加力时观察到,RANKL的表达有所增加,但是OPG的表达没有发生变化。Maddi等[17]运用超声波对成骨细胞进行作用,观察到与对照相比 OPG的表达明显增加,但 RANKL的表达无变化。相比之下,本实验运用 FSS对 MC3T3-E1细胞加力,一方面增加了 OPG的表达,另一方面抑制了 RANKL的表达,二者的协同作用使 OPG/RANKL显著增加。这些结果提示,与其他机械刺激相比,FSS对成骨细胞中 OPG和 RANKL的表达更加有效。

流体剪切力对 OPG和 RANKL的作用影响骨组织形成与吸收的动态平衡。加力 90 min后,OPG/RANKL的比值仍在增大,但 OPG的增长及RANKL的减少趋势较 60 min时相对放缓,说明成骨组织逐渐适应了 FSS的作用,对 FSS的敏感性有所下降。在 120 min内,加力的时间越长,OPG/RANKL的比值增长得越多,这说明对成骨细胞而言FSS可能具有剂量依赖性和可蓄积性。张成俊等[18]证实,一些影响成骨细胞增殖周期的因子CDK 2和 CDK 4对 FSS作用也具有剂量依赖性和可蓄积性。与 Tintut等[19,20]相同,本实验中流体剪切力对 OPG和 RANKL的作用使得大量的 OPG中和了 RANKL,造成破骨细胞的产生和活化障碍并且促进破骨细胞的凋亡,进一步影响了骨组织新陈代谢的动态平衡。

在本研究中,流体剪切力对 OPG和 RANKL的影响在蛋白水平被定量化,流体剪切力作为骨组织新陈代谢的重要调节器之一得到验证,流体剪切力对 OPG的上调和对 RANKL的下调作用直接影响着成骨细胞和破骨细胞,进而影响骨组织代谢的动态平衡,有关这方面的研究将在骨组织形成和修复、生物工程、骨质疏松及骨病的研究和治疗中发挥巨大的作用。因此,详尽地研究流体剪切力与骨组织的关系对了解骨组织的作用具有重大意义。

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