耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌产β内酰胺酶研究

侯盼飞, 应春妹, 汪雅萍, 叶杨芹, 张灏旻

鲍曼不动杆菌是医院感染的重要病原菌,主要引起医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性肺炎、菌血症、尿路感染和继发性脑膜炎等。近年来鲍曼不动杆菌的耐药性呈上升趋势,尤其是出现了碳青霉烯类抗生素耐药菌株,给临床治疗带来很大挑战。产β内酰胺酶是鲍曼不动杆菌对β内酰胺类抗生素耐药的重要原因,本课题对80株临床分离鲍曼不动杆菌对13种抗菌药耐药性及产β内酰胺酶进行研究。

材料与方法

一、材料

(一)临床菌株 收集2009年1月—10月我院分离鲍曼不动杆菌共80株,其中亚胺培南耐药50株,敏感30株,标本种类包括痰液、引流液、尿液、血液、脑脊液、脓液、咽拭子、胆汁和插管等。所有菌株经VITEK-32细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)鉴定。

(二)质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922。

(三)抗菌药物 阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢西丁、头孢哌酮、他唑巴坦、舒巴坦、磺胺甲唑-甲氧苄啶、美罗培南和多黏菌素B等抗菌药物制剂购自上海科佳药检器材公司。头孢吡肟由中美上海施贵宝制药有限公司惠赠,亚胺培南由默沙东制药有限公司惠赠,哌拉西林由复旦大学附属华山医院抗生素研究所惠赠。

(四)试剂 T aq DNA 聚合酶、10×PCR buffer(含MgCl2)、dNTPs mixture为上海闪晶生物科技有限公司产品。

(五)仪器 PCR扩增仪为美国ABI公司产品,凝胶成像仪为上海天能科技有限公司产品。

二、方法

(一)药敏试验 用琼脂稀释法检测80株鲍曼不动杆菌对13种抗菌药的MIC。实验方法及结果判断标准参照CLSI 2009年版。①抗菌药物配制：抗菌药物原液均配制成4 000 mg/L,试验中采用倍比稀释法稀释至所需浓度,最终试验浓度从256～0.0625 mg/L。头孢哌酮-舒巴坦中头孢哌酮、舒巴坦的配制比例为2∶1,磺胺甲唑与甲氧苄啶比例为9∶1,哌拉西林-他唑巴坦中哌拉西林浓度从256～0.0625 mg/L,他唑巴坦为4 mg/L。②菌液制备：取培养过夜的纯菌落,用生理盐水调至0.5麦氏单位浊度,再稀释10倍,取1 μ L用于接种。35 ℃孵育20～24 h,观察结果。③用WHONT 5软件分析结果,SAS 8.0软件进行统计分析。

(二)AmpC酶表型检测 参照 Coudron等[1]报道的三维试验方法。①酶粗提物制备：挑取血平皿上已纯培养18～24 h的菌落3～5个,接种于营养肉汤中,35℃培养6 h左右,定时混匀,4 000 r/min离心30 min,弃上清液,沉淀物于-80℃和35℃反复冻融8次(每次要冻2 h以上再取出融化),加入0.01 mol/L PBS(pH7.0),4℃10 000 r/min离心20 min,上清液即为酶提取物。②三维试验：将0.5麦氏单位浓度的大肠埃希菌(ATCC 25922)菌液涂布于MH平皿上,取一头孢西丁药敏纸片贴在平皿中心,用无菌刀片在离纸片边缘5 mm处切一小槽,在小槽内加入50 μ L酶提取物,35℃培养过夜观察结果。当抑菌圈不完整,小槽近头孢西丁纸片端与抑菌圈交接处出现向平皿中心扩大的长菌区为AmpC酶阳性,抑菌圈完整者为阴性。

(三)EDTA纸片协同试验 按照纸片扩散法药敏试验操作规程,将细菌配成0.5麦氏单位浓度,均匀涂布在MH琼脂平皿上,分别贴2张亚胺培南药敏纸片,2纸片中心相距＞25 mm。在其中1张纸片上滴加500 mmol/L(pH=8.0)EDTA溶液5 μ L。35 ℃培养 20 h观察结果。亚胺培南+EDTA纸片与单纯亚胺培南纸片的抑菌圈直径之差≥7 mm为金属酶阳性[2]。

(四)模板制备 从血平皿上挑取3～4个受试菌菌落于生理盐水300 μ L中,制成细菌悬液,混匀。10 000 r/min离心5 min,弃上清液,加入无菌双蒸水300 μ L,混匀。细菌悬液100℃水浴,15 min后离心,12 000 r/min离心2 min,取上清液即为DNA模板。

(五)PCR扩增 总反应体系为 50 μ L,其中10×缓冲液(含 MgCl2)14 μ L,dNTPs(各 2.5 mmol/L)mixture 1 μ L,DNA 模 板 2.5 μ L,上下游 引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ L,Taq 酶 0.5 μ L,dH2O 31 μ L。反应条件：94℃预变性5 min,然后94℃变性30 s,54℃复性45 s(OXA-51为52℃复性50 s),72℃延伸1 min,共30个循环,最后72℃延伸7 min。PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶(含EB)电泳观察特异性扩增条带,引物序列见表1。

(六)测序 由上海闪晶分子生物科技有限公司协助完成,结果用基因库中的Blast程序进行同源分析。

结 果

一、药敏试验结果

50株IRAB中MIC50＞128 mg/L的抗菌药物有阿米卡星、环丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮、头孢西丁、磺胺甲唑-甲氧苄啶,MIC50在32～128 mg/L的抗生素有美罗培南、头孢哌酮-舒巴坦、头孢吡肟、头孢他啶,MIC50＜8 mg/L的抗菌药物有左氧氟沙星和多黏菌素B。30株ISAB对头孢西丁耐药率最高,MIC50为256 mg/L,MIC50＜8 mg/L的药物有美罗培南、阿米卡星、头孢哌酮-舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟和多黏菌素B。统计学分析显示,IRAB与ISAB除对头孢吡肟、头孢西丁、多黏菌素B耐药性较一致外,对其他抗菌药耐药性差异均有统计学意义(P＜0.01),见表2。

表1 PCR扩增基因型及引物序列Table 1.The sequences of primers used for PCR

表2 IRAB和 ISAB耐药性比较(MIC：mg/L)Table 2.Resistance comparison between IRAB and ISAB strains(M IC：mg/L)

二、三维试验结果

50株IRAB中有42株AmpC表型阳性(84%),30株ISAB中有9株阳性(30%)。

三、EDTA纸片协同试验结果

80株鲍曼不动杆菌中均未检测到金属酶。

四、基因检测结果

在50株IRAB中OXA-23、AmpC阳性的分别为36株(72%)和45株(90%)。其中OXA-23和AmpC同时阳性的 35株(70%);30株 ISAB中OXA-23、AmpC阳性的分别为4株(13.3%)和20株(66.7%),其中同时阳性的4株(13.3%),见图1。IRAB与ISAB相比,OXA-23阳性检出率差异有统计学意义(P＜0.01),而AmpC阳性率差异无统计学意义(P＞0.05),80株细菌中OXA-51均为阳性,未检测到 OXA-24、OXA-58、IMP-1 、IMP-4、VIM-2基因,见表3。

五、测序结果

将PCR扩增产物纯化后进行测序,结果经blast比对,OXA-23、OXA-51和AmpC 与Genbank相关基因同源性分别为100%、99%和99%。

图1 部分IRAB菌株 AmpC、OXA-51和OXA-23β内酰胺酶基因PCR扩增产物电泳图FIG.1.Electrophoresis of PCR products for β-lactamase genes AmpC,OXA-51 and OXA-23 in some imipenem-resistant Acinetobacterbaumannii strains

表3 AmpC和OXA型酶基因在鲍曼不动杆菌中的检测结果Table 3.Distribution of AmpC and OXA genes in Acinetobacter baumannii

讨 论

鲍曼不动杆菌广泛分布于周围环境和正常人皮肤、呼吸道等部位,是一种重要的条件致病菌,近年来耐药率逐年升高。尤其是耐亚胺培南菌株的出现,给临床治疗带来很大挑战,使许多患者面临“无药可治”的困境。本研究对我院临床分离鲍曼不动杆菌耐药性检测发现,亚胺培南耐药菌株同时对氨基糖苷类、喹诺酮类、头孢菌素类、磺胺类等抗菌药耐药,但仍对多黏菌素B敏感,含酶抑制剂头孢哌酮-舒巴坦的抑菌效果优于单药头孢哌酮。这与2008年CHINET监测的结果基本一致[3]。统计学分析显示,IRAB与ISAB相比,对头孢吡肟、头孢西丁、多黏菌素B耐药性较一致,对其他抗菌药耐药性差异有统计学意义。

产β内酰胺酶是鲍曼不动杆菌对β内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。按照Ambler分类方法,β内酰胺酶分ABCD 4类。A类酶,主要是超广谱酶(ESBLs),如SHV、TEM、PER、CTX等。B 类酶,活性位点为2价金属阳离子,故又被称为金属β内酰胺酶(MBLs),对β内酰胺类抗生素具有广泛的水解作用,目前在鲍曼不动杆菌中发现的B类酶包括 IMP-1 、IMP-4 、IMP-6、VIM-2、VIM-3、SIM-1等[4],但国内对此类酶报道较少。C类酶,即AmpC酶,主要分解第三代头孢菌素及单环酰胺类,可被氯唑西林、Syn 2190抑制。本研究中,PCR检测发现45株IRAB、20株ISAB AmpC基因阳性,阳性率分别为90%和66.7%,χ2检验表明,差异无统计学意义。结合药敏试验结果,我们推测我院AmpC基因的高检出率可能主要与头孢菌素类耐药有关而与亚胺培南耐药关系不大。与三维试验结果比较,我们发现共有14株PCR结果阳性而表型阴性的菌株,可能原因是表型检测灵敏度较低引起的假阴性。D类酶,又被称为苯唑西林酶[5],是鲍曼不动杆菌耐菌药机制中研究最多的。根据基因同源性不同,又可分为 4组 ：OXA-23、OXA-24、OXA-51 和 OXA-58。OXA-51广泛存在于鲍曼不动杆菌中,常被认为是该菌的标志性基因,可引起对苯唑西林、氯唑西林和亚胺培南的天然低水平耐药。本研究的80株鲍曼不动杆菌中,OXA-51也均为阳性。OXA-23,是目前报道最多的β内酰胺酶,可引起对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等多种抗生素耐药,可被舒巴坦、克拉维酸等抑制。本研究检测到36株IRAB(72%)、4株 ISAB(13.3%)OXA-23基因阳性,与我们前期研究及其他学者报道基本一致[6-7]。具有OXA-23基因通常对碳青霉烯类抗生素耐药,但我们研究发现4株OXA-23基因阳性而对亚胺培南敏感的菌株,这4株细菌对头孢哌酮、哌拉西林-他唑巴坦、磺胺甲唑-甲氧苄啶均耐药,对美罗培南中介或耐药。李蓉等[8]也发现OXA-23阳性而对亚胺培南敏感的菌株,其原因我们还将做进一步研究。统计学分析显示,IRAB与ISAB的OXA-23阳性率有显著差异,推测它可能是造成鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因之一。

本组IRAB中OXA-23基因广泛存在,是导致本院分离的鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因,是否有其他机制参与耐药尚有待进一步研究。同时提示我们应加强耐药表型与耐药机制的研究,严格监测、合理使用抗菌药,以防止耐药菌株播散。

[1] Coudron PE,Moland ES,Thomson KS.Occurrence and detection of AmpC β-lactamases among Escherichia coli,K lebssiella pneumonie,and Proteus mirabilis isolates at a veternans medical center[J].J Clin Microbiol,2000,38(5)：1791-1796.

[2] 王春新,谢国强,赵琪,等.纸片协同试验检测金属β内酰胺酶细菌[J].中华检验医学杂志,2003,26(10)：634.

[3] 汪复,朱德妹,胡付品,等.2008年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2009,9(5)：321-330.

[4] Jones RN,Biedenbach DJ,Sader HS,et al.Emerging epidemic of metallo-β-lactamase mediated resistances[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2005,51(2)：77-84.

[5] Brown S,Amyes SG.The sequences of seven class D β-lactamases isolated from carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii from four continents[J].Clin Microbiol Infect,2005,11(4)：326-329.

[6] Zhou H,Yang Q,Yu YS,et al.Clonal spread of imipenemresistant Acinetobacter baumannii among different cities of China[J].J Clin Microbiol,2007,45(12)：4054-4057.

[7] Ying CM,Ling T K,Lee CC,et al.Characterization of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in Shanghai and Hong Kong[J].J Med Microbiol,2006,55(Pt 6)：799-802.

[8] 李蓉,李文林,石小玉,等.鲍曼不动杆菌OXA-23型碳青霉烯酶基因的研究[J].中国抗生素杂志,2007,32(7)：123-126.