当归补血滴丸提取工艺研究

刘丽芳 卢海刚 边虹铮 曹德英

当归补血汤始载于金元四大家之一李东垣的《内外伤辨惑论·暑伤胃气论》(公元1247年)，为经典的气血双补名方，本方组成简单，由黄芪一两，当归二钱，芪归用量是5∶1，是现代复方研究的代表方剂。重用黄芪大补脾肺之气，以资生血之源，与当归合用，养血和营，则阳生阴长，气血两旺，两药互伍，共同发挥补气生血活血作用，在临床上有着广泛的应用［1，2］。滴丸剂作为现代中药剂型，是近年来中药制剂研究的热点。中药材的提取对于滴丸质量起至关重要作用，为此，本研究拟以水提取当归和黄芪中的有效成分，在此基础上，进一步研究影响提取的因素，优化提取工艺。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Re53-98旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);TG328B电光分析天平(上海天平仪器厂);高效液相色谱仪、色谱工作站(Lablliance公司);当归、黄芪购自兰州黄河药材公司;阿魏酸对照品购自中国药品生物制品检定所。

1.2 当归补血滴丸提取工艺研究

1.2.1 煎煮时间的选择:取当归10 g，黄芪50 g，加入10倍量水，煎煮1 次，时间分别为0.5、1、1.5、2 和2.5 h。滤过，滤液于旋转蒸发仪上减压浓缩，所得浓缩液置100 ml棕色量瓶内，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，比较不同煎煮时间时阿魏酸的含量。

1.2.2 煎煮次数的选择:取当归10 g，黄芪50 g，加入10倍量水，煎煮时间1 h，分别煎煮1、2、3、4和5次。滤过，滤液于旋转蒸发仪上减压浓缩，所得浓缩液置100 ml的棕色量瓶内，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，比较不同煎煮次数时阿魏酸的含量。

1.2.3 加水量的选择:取当归 10 g，黄芪 50 g，分别加入 6、8、10、12、15倍量水，煎煮1 h，滤过，滤液于旋转蒸发仪上减压浓缩，所得浓缩液置100 ml的棕色量瓶内，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，比较不同加水量时阿魏酸的含量。

1.2.4 提取工艺的优化:根据以上单因素考察结果，采用三因素三水平的正交试验设计方案，以阿魏酸含量为指标，进一步考察煎煮时间、煎煮次数和加水量的影响。

1.3 含量测定

1.3.1 色谱条件:色谱柱:Kromasil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.5% 冰醋酸水溶液(35∶65);流速:1.0 ml/min;检测波长:322 nm;柱温:40℃。

1.3.2 标准曲线制备和样品溶液的预处理:精密称取干燥恒重的阿魏酸对照品约5 mg，加水溶解并定溶至100 ml量瓶中，作为储备液。用此储备液分别配制 2.5、5.0、10.0、12.5 和25.0 μg/ml的溶液。按上述色谱条件，各精密吸取 20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品峰面积对浓度进行线性回归，求回归方程。采用甲醇沉淀法，取样品溶液10 ml置50 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度;精密吸取定容后溶液10 ml，3000 r/min 离心10 min;取上清液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，精密吸取20 μl注入液相色谱仪，测定，即得。

2 结果

2.1 当归补血滴丸提取工艺研究 根据煎煮时间、煎煮次数和加水量的单因素考察结果表明，煎煮时间超过1.5 h、煎煮次数超过3次，用水量超过12倍，阿魏酸含量无明显增加，因此，采用三因素三水平的正交试验设计方案，因素水平安排见表1，正交试验安排见表2，方差分析结果见表3。方差分析结果表明:A、C因素的影响差异有统计学意义(P＜0.05)，B因素的影响差异无统计学意义(P＞0.05)。因此，确定最佳提取条件为 A3B3C2，即加12 倍量水，提取2 次，1.5 h/次。

2.2 验证试验 以最优处方提取的三批药材，结果阿魏酸平均含量为 (33.6±2.6)μg/g，验证试验结果与正交试验基本一致，说明所筛选的提取工艺条件稳定可行。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析

2.3 标准曲线线性关系 以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程:Y=8759.3X+1091.3，r=0.9994。结果表明在2.69 ～26.9 μg/ml范围内阿魏酸的浓度与峰面积呈良好的线性关系。

3 讨论

现代药理学研究表明，阿魏酸具有抗氧化和清除自由基作用，能有效抑制血小板聚集和血栓形成［3，4］。阿魏酸是中药当归中的主要有效成分之一，也是当归补血汤中的主要药效物质，故本研究以阿魏酸的含量为指标筛选当归补血汤最佳提取工艺。据文献报道，阿魏酸不稳定，见光易分解［5］。对照品溶液、供试品溶液均应置棕色瓶中保存，否则易发生分解而使含量降低，故在标准品及样品的配制中使用棕色量瓶，并在水煎液的制备过程中避免光线直射。阿魏酸为弱有机酸，在标准品溶液和样品溶液中加入一定量的冰醋酸，使得阿魏酸的稳定性显著增加，提高了分析结果的准确性。

目前，HPLC测定中药制剂中阿魏酸的文献报道较多，其中样品溶液的常规预处理方法有两种，萃取法［6］和甲醇沉淀法［7］。萃取法得到图谱中杂质大部分已经被除去，杂质峰数目较少，但阿魏酸柱效相对较低，色谱峰面积较小。甲醇沉淀法得到的图谱中阿魏酸柱效较高，色谱峰面积大，虽然杂质峰较多，但与阿魏酸分离度较好，不影响分析结果。并且从操作的角度讲，萃取法操作过程繁琐，样品需要反复的洗涤与萃取，因而易造成阿魏酸的损失。甲醇沉淀法只经过一步离心操作，过程简单，加入甲醇后，药液滤过更容易。因此，我们最终选用甲醇沉淀法作为当归补血汤水提液样品的预处理方法。

1 黄兆胜，危建安.当归补血汤药理作用研究进展.中药药理与临床，2001，17:48-49.

2 范颖，陈信义.当归补血汤源流及配伍效用关系研究进展.中国实验方剂学杂志，2006，12:61-65.

3 邓永健，郭志伟，王萌.当归的化学成分及其药理作用研究进展.新疆中医药，2006，24:109-113.

4 夏泉，张平，李绍平，等.当归的药理作用研究进展.时珍国医国药，2004，15:164-166.

5 侯林中，刘晓红，张熙洁.正交试验优选宽心口服液中当归川芎提取工艺.中国药学，2007，42:794-796.

6 胡传芹，宋金春，曾俊芬，等.高效液相色谱法测定复方当归注射液中阿魏酸含量.中国医院药学杂志，2005，25:441-443.

7 陈璐，陶婷婷，王天志.RP-HPLC测定藏药柳茶中阿魏酸和异阿魏酸的含量.华西药学杂志，2006，21:196-197.