4种观察副溶血弧菌表面形态的方法比较

李蓝天，赵 勇，潘迎捷

（上海海洋大学食品学院，上海 203106）

表面形态观察作为分子生物学研究的重要手段，是研究基因功能的基础，也是了解基因功能的首要信息和重要依据。对于微生物来说，在逆境条件下基因组的表达量发生相应变化，可能导致微生物的表面形态随之发生一系列变化，因此对逆境条件下表面形态的观察也是研究抑菌机理的重要手段。常用的观察方法有普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜（负染）。副溶血弧菌（又称嗜盐菌 Vibrio Parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌或稍弯曲弧菌，是引起食源性疾病的重要病原之一。该菌生活在海水中，可以由鱼类、蛤、蚌类、甲壳类等水产动物中分离得到。为了真实反映菌的生长状态，进行外表面形态的观察时要求尽可能维持菌体原貌，因此对样品的制备过程的要求较高。为此，笔者针对上述几种进行表面形态观察的技术方法，以副溶血弧菌为材料，进行了样品的收集、制备和观察。并且根据观察所得到的结果，比较各种方法的优劣，并对操作过程中可能遇到的问题以及需要注意的事项分别进行了阐述和说明。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 由本实验室从海产品中分离得到，经生理生化鉴定和16 s测序确定为副溶血弧菌。

1.1.2 仪器设备与试剂 供试仪器为相差显微镜、荧光显微镜、扫描电子显微镜（JEM-7500F）、透射电子显微镜（JEM-2100）、CO2临界点干燥仪、载玻片、盖玻片等。供试试剂为吖啶橙、锇酸固定液（锇酸，戊二醛）、磷酸缓冲液（PBS，0.1 M，pH 7.4）、酒精、乙酸异戊酯、去离子水，磷戊酸等。

1.2 方法

1.2.1 菌种的培养 实验菌株接种在TSA斜面上，37℃培养20 h至长出单菌落，挑取任意单菌落接种于TSB液体培养基中后，37℃摇床震荡培养10 h。取10 μL菌悬液接种于新鲜TSB液体培养基中，37℃摇床震荡培养4～5 h至对数生长期，收集菌悬液，即为本实验观察所用材料。

1.2.2 相差显微镜观察 用移液枪吸取少量菌悬液点在在玻片上，均匀涂开。然后盖上盖玻片，置于相差显微镜下观察拍照。

1.2.3 荧光显微镜观察（吖啶橙染色） 取正常状态的菌悬液5 μL点在载玻片上。混匀，30 s后盖上盖玻片，要赶尽气泡。然后置于荧光显微镜下，利用紫外光源并加滤光片，即可观察拍照。

1.2.4 扫描电子显微镜观察 （1）样品的收集。取菌悬液 5～10 mL，8 000 rpm 离心 5 min，弃上清，重复此操作，将菌体收集到1.5 mL离心管中，得到样品菌团。

（2）漂洗与固定。磷酸缓冲液漂洗2次，每次将菌体重悬后8 000 rpm离心3 min使其重新聚集，以洗去多余的培养剂。加入戊二醛固定液并将菌体重悬于固定液中，4℃固定6～10 h。

（3）漂洗与后固定。磷酸缓冲液漂洗2次，每次重悬后静置15 min再离心使其沉淀，以洗去多余的醛类物质，以防醛类与锇酸反应。加入锇酸固定液并将菌体重悬于固定液中，4℃后固定4～6 h。

（4）脱水与干燥。用磷酸缓冲液清洗沉淀3次，每次重悬后静置20 min再离心使其沉淀。然后利用乙醇梯度脱水：30%、50%、70%、90%各1次。脱水过程中每次重悬后静置15 min。再利用100%乙醇、乙酸异戊酯各重悬2次，每次20 min后利用临界点干燥仪中进行CO2临界点干燥。

（5）观察拍照。脱水干燥之后的样品需要保存在干燥缸中，尽量干燥后一周内进行扫描电镜的观察。

1.2.5 透射电子显微镜负染 透射电镜负染可用于观察活菌。挑取生长在固体培养基上的菌落，用去离子水稀释后点在铜网上。自然晾干或37℃烘干后，利用磷戊酸染色10 s，即可直接置于透射电镜下观察[1-2]。

2 结果与分析

2.1 相差显微镜观察

相差显微镜和普通光学显微镜在传统微生物学研究中常用来菌落计数，其最大放大倍数为1 000倍。因此只能观察到细胞的大体形态，不能用来观察细胞表面的细微变化，相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏代替可变光栏，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴调中望远镜及滤色片。这些特殊装置能使活细胞或未经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅之差，产生明暗变化，使人的肉眼能够辨认出来[3]。对于微生物而言，相差显微镜用于不染色或染不上色的细菌、螺旋体、真菌孢子等的快速辨认，特别是对具有鞭毛、荚膜等特殊形态微生物的鉴别。相差显微镜由于制样时没有经过染色或干燥等剧烈处理手段，所以保存了样品最原始的状态，而且可以观察到样品的运动状况。图1即为相差显微镜观察的结果，可以观察到副溶血弧菌的分裂状态。

图1 相差显微镜下的副溶血弧菌

2.2 荧光显微镜观察

吖啶橙染色后的样品在荧光显微镜下观察的图像相对清晰很多，并且由于吖啶橙也可以将DNA、RNA、蛋白质、脂肪、细胞膜等结构染色，因此可以观察到样品的运动状况和菌体细胞之间的连接现象以及外分泌物的状况等。吖啶橙（Acridine Orange，AO）即 3，6－（二 甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式为 C17H19N3·HCl·ZnCl2，分子量为 438.12，是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488 nm，阻断滤光片波长515 nm。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光。吖啶橙与DNA结合量少发绿色荧光，而与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。因此吖啶橙能使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞的黄荧光会减弱甚至消失。图2为副溶血弧菌吖啶橙染色后的荧光显微镜观察结果。图2a为正常生长的副溶血弧菌染色后的观察结果，图2b为某种逆境状态下副溶血弧菌应对外界环境压力的反应现象。

图2 荧光显微镜下的副溶血弧菌

2.3 扫描电子显微镜观察

冷场发射扫描电子显微镜的放大倍数可达数万倍到数十万倍，因此可以清晰地观察到细胞表面的形态[4]。但是使用扫描电子显微镜进行观察时由于样品的前处理过程中需要进行反复多次的离心和重悬操作，会导致鞭毛会在前处理时几乎全部脱落。因此对于长有鞭毛的菌体样品来说，此类方法不适于鞭毛形态的观察。同时外分泌物也会被洗脱，所以外分泌物状态也无法进行观察。这一类显微镜要求样品绝对干燥，因此需要在不改变样品外观形态的前提下，对样品进行一系列的脱水处理。要注意离心时转速不宜过高，否则会对细胞形态造成破坏，一般采用8 000 r/min离心5 min即可，也可以降低转速同时适当延长离心时间。重悬菌体沉淀时如果采用移液枪吸打的方法也可能对菌体细胞造成破坏，所以尽量避免采用这种方法。但可以剪掉移液枪头的尖端以减少对样品的伤害。副溶血弧菌是一类嗜盐畏酸菌，因此在样品的前处理过程中，磷酸缓冲液要尽量调至与培养基相同的pH值和盐度。图3为扫描电镜观察副溶血弧菌的图像。

2.4 透射电子显微镜观察

透射电镜负染的方法耗时短，所得到的结果非常接近样品活体时的状态。样品的前处理非常简单易行，对细胞的伤害很小，因此可以基本上保存鞭毛。而且透射电镜的放大倍数高，因此可以对样品进行更细致的观察[5]。但是该方法对样品的要求比较严格，而且培养基中的盐类和菌体的外分泌物等都会严重影响观察效果，所以一般使用生长在固体培养基上的菌落进行此类实验的样品制备。而液体培养基培养的菌体必须经过离心和清洗后才能制备。单纯此方法只能得到单个细胞的表观形态的观察图像，对于需要统计表型数据的实验并不适用。图4是用透射电子显微镜负染观察副溶血弧菌的图像，箭头指示即为鞭毛。

图3 扫描电子显微镜下的副溶血弧菌

图4 透射显微镜下的副溶血弧菌

3 总结

本实验中采用了荧光显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜（负染）观察副溶血弧菌的表面形态。这些方法有各自适用的范围，需要配合使用才能达到对菌体细胞进行全面真实地观察的目的。

试验对比了四种观察微生物表面形态的显微观察方法：相差显微镜、荧光显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜。这4种方法各有优劣，并且都有各自适用的范围。相差显微镜可以用于观察菌体的运动状况和单个菌体的大体形态，但无法观察细胞的微小变化；荧光显微镜可用于细菌计数、区分正常细胞和死细胞以及菌体细胞之间的连接现象和外分泌物的宏观情况等；扫描电子显微镜可观察到菌体细胞表面的微观形态，包括细胞壁褶皱等结构的细微变化，但不适于鞭毛和外分泌物的观察；透射电子显微镜（负染）可观察细菌活体的形态，可以对鞭毛和外分泌物等进行观察，但是不适用于需要表型统计的实验。

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