信号分子H2O2调节抗氧化系统提高高羊茅耐热性研究

王艳,李建龙,余醉,薛峰

(南京大学生命科学院,江苏 南京210093)

高羊茅(Festuca arund inacea)是我国亚热带地区应用最为广泛的一种冷季型草坪草,然而,高温胁迫仍然是其在该地区应用的首要限制因子[1]。夏季高温会造成草坪质量下降,叶色枯黄,病、虫、杂草危害加剧等各种问题,因此冷季型草坪草耐热性和抗热调控机理的研究受到广泛关注。当热胁迫发生时,植物细胞内的氧化还原平衡遭到破坏,过氧化氢(H2O2)被逐渐积累。H 2O2能与植物体内的DNA、蛋白质和脂类发生反应,造成氧化伤害和细胞代谢失调[2]。但是,植物体内存在抗氧化酶和抗氧化剂,可以形成复杂而有效的应激机制,阻止或者延缓氧化伤害的发生。过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是植物中最常见的抗氧化酶,抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环也是植物体内清除H2O2的重要抗氧化系统,它由抗氧化剂,抗坏血酸和谷胱甘肽,以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)等抗氧化酶共同组成。逆境胁迫下AsA和GSH的含量越高,或者各种抗氧化酶的活性越高,则物种的抗逆性越强,这已经在许多植物中都被证明[1-4]。

然而,最近的研究认为胁迫初期由于抗氧化系统的存在和激活,低浓度活性氧不但不会造成氧化伤害,还有可能起到传递压力信号的作用,只有当其积累量超出了清除系统的清除能力时,氧化伤害才会形成[5]。H 2O2在植物细胞中存在时间长;可以在细胞间跨膜长距离传递;能够快速生成并响应于各种环境胁迫,这些都是细胞中信号分子的重要特征,因此,H2O2作为信号分子的生理功能在最近几年引起广泛的关注[5]。H2O2在环境胁迫防御反应中的信号作用也得到证实,H 2O2预处理可以提高玉米(Zeamays)幼苗的耐寒性[6];大麦(Hordeum vulgare)种子经过H2 O2处理后提高了其幼苗的耐盐性[7],并且抗性的获得与抗氧化酶活性提高以及GSH含量变化相关。

逆境条件下植物首先需要感受逆境信号,并在细胞内传递这些信号,使植物得以对不良环境做出响应,进而通过应激反应提高植物的耐受性和抗性。对逆境信号的生理功能研究不仅可以揭示植物抗逆性机理,而且对推动草坪植物的分子遗传学和进化生物学研究也非常重要。然而有关草坪草信号分子的研究还很少,因此,本研究探讨了低浓度H 2O2预处理对高羊茅叶片中抗氧化系统的信号调控作用及与其耐热性的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料与方法

实验材料为凌志高羊茅(F.arundinacea cv.Barlexas),草坪草种子购自北京克劳沃种子公司。2008年4月初选择健康的草坪草种子播种在装有混合培养基质(沙子∶蛭石∶有机营养土=3∶1∶1)的聚乙烯花盆中。所有盆钵在室外自然光照下进行培养,气温为15～26℃。每周用Hoagland营养液浇灌1次,每天浇水。30 d后将所有盆钵转移到人工气候箱培养14 d,管理方式同上,人工气候箱被设置为14 h的光周期,光照强度为400 μmol/(m2·s),相对湿度为(65±10)%,温度为26/15℃(昼/夜,对照温度)。

实验设对照(CK)和H 2O2预处理(HT),预处理植株用10mmol/L的H2O2水溶液(预实验筛选出的最佳浓度),对照用等量的蒸馏水,均完全喷湿叶片。预处理植株先在正常生长温度(15/26℃,昼/夜)下培养12 h使H 2O2被高羊茅叶片充分吸收,然后将对照和处理植株都转入38/30℃(昼/夜,处理温度)的培养箱中进行高温胁迫,光照、相对湿度以及管理方式同上。分别在胁迫第0,3和6天取不同处理和对照的高羊茅叶片测定POD、CAT、APX、GR、GPX和谷胱甘肽S转移酶(GST)的活性、AsA、氧化型抗坏血酸(DHA)、GSH 和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量,以及胁迫过程中的丙二醛(MDA)和H2O2水平。

1.2 测试指标

1.2.1 MDA含量的测定 根据硫代巴比妥酸(TBA)显色法[8]。

1.2.2 H2O2含量的测定 根据Dagmar等[9]的方法。

1.2.3 抗氧化剂AsA、DHA、GSH和GSSG含量的测定 取样品材料0.2 g,用5 m L预冷的磺基水杨酸(5%)在冰浴中碾磨混匀,然后在4℃,10 000 r/min下低温离心20 min分离匀浆,上清液根据李忠光等[10]的方法用以测定A sA、DHA、GSH 和GSSG的含量。

1.2.4 抗氧化酶的提取和活性测定 样品在5m L预冷的0.05mmol/L磷酸钾缓冲液[pH值7.6,内含2%交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.5mmol/L AsA]中冰浴研磨。匀浆于10 000 r/min,4℃离心20min,上清液即为酶粗提液,用于测定各种抗氧化酶的活性。POD、CAT、APX活性测定根据Larkindale和H uang[2]的方法。GR活性测定根据Smith等[11]的方法。GPX和GST使用由南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[8]。

1.3 数据统计与分析

实验采用随机区组设计(4个重复)。所有数据采用单因素方差分析,实验值以平均值±标准误表示。采用t检验进行差异显著性检验,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 H2O2对高羊茅高温胁迫下MDA和过氧化氢含量的影响

在胁迫的0和3 d,高羊茅叶片中的MDA含量变化不显著(P>0.05)(图1A),表明在胁迫的前3 d植株体内的自我防御系统足以保护植物免受伤害。而在胁迫第6天,处理和对照植株中的MDA含量都显著升高(P<0.05),并且处理叶片中的MDA含量显著低于对照(P<0.05)。胁迫前(0 d)预处理高羊茅叶片中的H2 O2浓度显著高于对照(P<0.05)。这可能是由于喷施外源H2O2在叶片中的残留,也可能是外源H2O2诱发的内源H2O2的升高。在胁迫第3天略低于对照,第6天对照和处理叶片中的H2O2浓度都被显著增加,但是处理中H 2O2浓度显著低于对照(P<0.05)(图1B)。与MDA的变化趋势一致,表明此时高温胁迫引起的氧化伤害已经形成。但是,喷施低浓度的H2O2减轻了草坪草叶片的氧化伤害。

2.2 H2O2对高羊茅高温胁迫下抗氧化剂含量的影响

AsA是一种重要的抗氧化剂,不但可以作为APX的底物,还可以直接和H2O2进行反应,使H2O2还原为H2O,同时A sA被氧化为DHA。在本实验中高羊茅对照和处理叶片中的AsA含量在高温胁迫第3天和第6天差异均不显著(P>0.05)(表1),但都显著高于胁迫前(0 d),表明热胁迫本身升高了AsA的含量。胁迫前处理和对照中的AsA含量差异不显著,可能意味着它在本实验中并没有直接受到外源H2O2的影响,而是通过APX参与了抗氧化反应。高羊茅对照与处理叶片中的DHA含量在胁迫过程中变化均不显著。总抗坏血酸的含量在高羊茅对照和处理叶片中都呈上升趋势,但增加不显著。受AsA、DHA和总抗坏血酸的含量不显著变化的影响,AsA/总抗坏血酸含量和AsA/DHA在高温胁迫前后都没有发生显著变化(P>0.05)。表明在6 d的热胁迫过程中DHA可以得到及时的还原,A sA的氧化还原状态保持动态平衡。

图1 外施低浓度H 2O2对高温胁迫下高羊茅叶片中MDA和H2O 2含量的影响Fig.1 Ef fects of p re-treatmentswith H 2O2 on MDA and H2 O2 content in F.arundinacea leaves during heatstress(38/30℃,day/night)

表1 高温胁迫下外施低浓度H 2O 2对高羊茅叶片中抗坏血酸相关参数的影响Table 1 Effects of pre-treatmentswith H2 O2 on parameters related to AsA in F.arundinacea leaves during heat stress(38/30℃,day/night)

不管是对照还是处理叶片中的GSH在高温胁迫第3天和第6天与胁迫前相比显著降低(P<0.05)(表2)。而对照和处理叶片中的GSSG在高温胁迫时相比胁迫前(0 d)都显著升高(P<0.05),但是胁迫第3天和第6天的GSSG差异不显著(P>0.05)。表明胁迫直接影响了谷胱甘肽的氧化和还原状态。胁迫过程中总谷胱甘肽含量在对照中变化不显著,而在处理叶片中变化显著。H2O2预处理在胁迫前显著提高了高羊茅叶片中的GSH含量(P<0.05),在胁迫第3天预处理中的GSH含量高于对照,差异不显著(P>0.05),但第6天显著低于对照(P<0.05)。处理植株中的GSH/总谷胱甘肽和GSH/GSSG在高温胁迫前低于对照,并且随着胁迫的进行逐渐降低。表明H 2O2预处理使GSH含量的升高,参与了随后热胁迫过程中的抗氧化反应,对高羊茅叶片细胞起到保护作用。

2.3 H2O2对高温胁迫下高羊茅抗氧化酶活性的影响

高温胁迫前(0 d)和胁迫过程中(第3天和第6天),H2O2预处理不显著地提高了高羊茅叶片中的POD和CAT活性(P>0.05)(表3)。表明外源H2O2可以在胁迫前增加CAT和POD的活性以抵御随后因高温而引起的氧化伤害。但是对照和处理叶片中的POD活性随胁迫的进行呈增加趋势,表明热胁迫本身诱导了POD的活性升高。而对照和处理叶片中的CAT活性都随胁迫的延长而逐渐降低,在高羊茅抵御热胁迫的过程中,CAT可能不是主要的抗氧酶。H2O2预处理在整个胁迫过程中都提高了高羊茅叶片中的APX活性,在胁迫前预处理中的APX活性比对照升高了50%,并且在胁迫第3天对照和处理中的APX达到峰值,显著高于胁迫前的水平(P<0.05)。GR的作用是将GSSG还原为GSH,与细胞内的氧化还原状态即GSH/GSSG直接相关。在实验中发现处理叶片GR在胁迫第3天和第6天显著高于对照40%左右,胁迫前(0 d)不显著高于对照。表明APX和GR对于高羊茅抗热性的获得具有重要作用。植物还可以以GSH为底物,通过依赖于GSH的保护酶GST和GPX直接参与膜脂过氧化的解毒过程。本研究发现H2O2预处理在热胁迫过程中显著提高了高羊茅叶片中的GPX活性,在0,3和6 d分别高于对照38%,116%和93%。但是,几乎没有改变GST的活性。可见H 2O2可以直接激活GPX,而对GST的无显著诱导作用,GPX可能是高羊茅抗热过程中一种重要的保护酶。

表2 高温胁迫下外施低浓度H2O2对高羊茅叶片中GSH相关参数的影响Table 2 Effects of pre-treatmentswith H2O2 on parameters related to GSH in F.arundinacea leaves during heat stress(38/30℃,day/night)

表3 高温胁迫下低浓度H2O2预处理对高羊茅叶片中抗氧化酶活性的影响Fig.3 Effects of pre-treatmentswith H2O2 on antioxdativeenzymes activity in F.arundinacea leaves during heat stress(38/30℃,day/night) U/(mg蛋白Protein·m in)

3 讨论

高温是制约冷季型草坪草生长、发育和影响草坪质量最重要的生态因子之一。高温会导致植物光合作用的下降,细胞膜的破坏,甚至整个植株的衰老和死亡。当胁迫发生时,胞外信号首先被植物质膜上的受体识别并结合,信号传递通路得以激活,胞外信号转变为胞内信号,再由胞内信使调节细胞内各种生理生化反应。胞内信使很少,往往是通用的。近年来研究发现低浓度的H 2O2可以直接诱导大量防御基因的表达和相关酶活性的升高,抵御胁迫伤害的发生[6,7,12]。因此,越来越多的学者认同胁迫初期低浓度的H2 O2可能起到胁迫信号的作用参与植物的防卫反应,而随着胁迫的进行,当H2O2的积累水平超过植株的清除水平时氧化伤害才发生。在本实验中发现胁迫前(0 d)高羊茅预处理叶片中H2O2含量升高,但是MDA含量未变化,表明此时H2O2没有对植物造成的氧化伤害。叶片中H2 O2含量的升高可能来自于外源H 2O2喷施的残留,也可能因为外源H2 O2诱发了内源H 2O2的升高。到胁迫第6天,处理和对照植株叶片中MDA和H 2O2含量都显著升高,但处理仍然低于对照。表明此时高温胁迫引起的氧化伤害已经形成,但是喷施H2 O2推迟了草坪草处理植株中氧化伤害的发生。

胁迫条件下,植物体内H 2O2的平衡与抗氧化酶的活性和抗氧化剂的含量密切相关。本研究发现H 2O2预处理在胁迫发生前(0 d)预先提高了高羊茅叶片中的POD、CAT、APX、GR和GPX的活性,表明低浓度的H2 O2可能起到一个中度胁迫的作用,代替植物的热锻炼过程诱导了植株的抗氧化系统,从而抑制了随后发生的胁迫伤害[13]。在以后的胁迫过程中,POD活性随着胁迫时间的增加而增加,它以酚类化合物为底物催化H2O2还原,而过氧化物酶参与了细胞分泌的酚聚合物形成木质素的过程,因此推测热胁迫中POD活性增加可能促进了草坪草的木质化过程,增加草坪草细胞结构的机械强度,更有利于保持细胞的稳定[14]。CAT可以直接催化H2O2的还原,然而在本研究中CAT活性随热胁迫的进行逐渐降低,表明热胁迫本身可能抑制了高羊茅叶片中的CAT活性。APX以AsA为底物催化H2O2还原为H 2O,启动AsA-GSH循环,胁迫前和胁迫过程中处理叶片的APX活性显著高于对照,表明APX在高羊茅抗热性的获得中起重要作用[15]。另外AsA也可以直接和H 2O2反应将其还原,同时AsA被氧化为DHA。不过在本实验中A sA的氧化型和还原型在6 d的热胁迫过程中基本保持了动态平衡,DHA及时得到还原。AsA更可能是通过APX参与了抗氧化反应。DHA可以以GSH为底物通过脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)被还原为AsA,在这个过程中引起GSH从还原型向氧化型(GSSG)的转变。而GR的作用是以NADPH为底物将GSSG还原为GSH,从而使A sA和GSH得以在AsA-GSH循环中循环,调节细胞的氧化还原状态。GR活性是这个循环的限制步骤[16]。对照和处理叶片中的GR活性一直高于对照,并且随着热胁迫地进行而升高,可见GR在高羊茅防御热胁迫过程中起到重要作用。

已有研究表明低温可以直接通过H 2O2浓度的改变和GSH/GSSG的改变激活细胞中的氧化还原信号传导途径[17]。本研究也得到同样的结论,H 2O2预处理在胁迫前直接改变了GSH/GSSG,并且这一比值随着胁迫的进行而降低,但是谷胱甘肽的总含量没有发生显著变化。GSH还可以通过2种依赖于GSH的保护酶GST和GPX直接参与膜脂过氧化的解毒过程[16]。GPX是动物细胞中的一种重要H2O2清除剂,但是现在的研究发现在植物中GPX也具有保护细胞免受氧化伤害的作用[18]。GST能催化还原型谷胱甘肽的巯基与多种亲电、亲脂底物的结合,生成水溶性的产物,从而降低底物的毒性,使膜免遭氧化伤害,它还具有过氧化物酶活性,能解除羟基过氧化物的毒性[19]。本实验结果发现H2 O2预处理在热胁迫过程中显著升高了高羊茅叶片中的GPX活性,而对GST活性没有影响。可见GPX是高羊茅体内清除氧化伤害的重要抗氧化酶之一,而GST对于高羊茅抵御高温胁迫无显著作用。综上所述,低浓度的H 2O2具有传递胁迫的信号分子作用,在胁迫发生前激活了高羊茅体内的抗氧化系统,即提高抗氧化酶活性和改变细胞的氧化还原状态(GSH/GSSG),从而减缓了随后发生的热胁迫对高羊茅的氧化伤害,提高了其抗热性。

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