添加菊科植物黄花蒿乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸组成的影响

王丽芳 卢德勋 高 民

CLA是一种含有共轭双键的十八碳二烯酸，具有抗癌、抗动脉粥样硬化及抗糖尿病等作用的脂肪酸。研究表明，菊科植物或其提取物可以增加乳中CLA的含量（Collomb等，2002；Cabiddu等，2006；Wallace等，2007）。

本试验采用奶牛乳腺组织体外培养法，研究添加菊科植物黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中CLA和其它脂肪酸组成的影响，旨在探讨菊科植物黄花蒿乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞中CLA合成的作用效果。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

二氧化碳恒温培养箱(Forma)、超净工作台（DLCJ-2N）、组织培养倒置显微镜(Olympuse，日本)、高压灭菌锅 (BGSB-3056 HIRAYAMA)、数显鼓风干燥箱（GZX-9140MBE）、超纯水机（21QX-P1518A Qunxian）、细胞计数板、电子天平、常温低速离心机、加样器、滤器(0.22 μm)、60 公分培养皿(Nuc)、RPMI1640 培养基（美国Gibco公司）、D-Hanks液(天津灏洋生物有限公司)、青霉素钠(Sigma)、硫酸链霉素(Sigma)。

1.2 试验材料

1.2.1 奶牛乳腺组织

乳腺组织来源于一头健康的泌乳期奶牛。取约1 g的乳腺组织，迅速置于含双抗的D-Hanks液的灭菌离心管中，带回实验室在超净台内移入含有双抗的D-Hanks液中反复冲洗组织，洗净乳腺组织上残余的乳汁和血污，尽量除去脂肪组织和结缔组织，然后用眼科手术剪将组织剪成约1 mm3左右的小块备用。

1.2.2 组织块培养

用牙科探针将剪碎的1 mm3左右的组织小块均匀种植于60 cm2的培养皿中，组织块间距以0.5 cm左右为宜。种植完成后，盖好培养皿盖，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养3 h左右，使组织块贴壁。然后将培养皿从培养箱取出，轻轻加入3～5 ml RPMI1640培养液，让培养液慢慢覆盖瓶底上的组织小块，静置培养箱(37℃，5%CO2)中培养。

1.2.3 黄花蒿乙醇提取物

黄花蒿乙醇提取物的冻干粉用二甲基亚枫(DMSO)溶解，配制成浓度为10 mg/ml的母液，再以细胞培养液稀释成所需浓度的工作液供试验用。

1.3 试验设计

体外培养奶牛乳腺组织，待细胞生长至对数增殖期,更换新鲜培养液，随机分为4组，使黄花蒿乙醇提取物的含量分别为0、2.5、5和10 mg/l组，提取物作用时间均为48 h。然后检测不同浓度黄花蒿乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸含量的影响。

1.4 乳腺上皮细胞中脂肪酸的测定

1.4.1 乳腺上皮细胞中脂肪酸测定的前处理

①取处理好的细胞，加2 ml细胞裂解液，裂解15 min，然后加4 ml正己烷/异丙醇溶液，再加Na2SO4溶液2ml，离心5300 r/min。提取上清液，在20 ml的水解管中，用氮气吹干试管；

②加入2 ml NaOCH3，在50℃水浴15 min，加入C19:0内标，然后加入2 ml盐酸/甲醇溶液，在80℃水浴1.5 h；

③冷却到室温，加入3 ml水和6 ml正己烷，震荡，静止分层或离心分层；

④吸取上层液体(尽量吸净)，定容10 ml，加无水硫酸钠，气象色谱法测定脂肪酸。

1.4.2 气相色谱的条件

样品用气相色谱分析，此仪器装有氢火焰离子检测器。所有样品的甲基酯用60 m×0.25 mm×0.25 μm柱子(DB-23石英毛细管柱)分离。柱温采用程序升温：开始温度为130℃，保持1 min，以6.5℃/min升至170℃，然后以1.5℃/min升至200℃，保持10 min，再以5℃/min升至最后温度220℃，保持5 min。载气是高纯氮气，进样器和检测器的温度是240℃，进样量 1 μl，分流比为 10： 1。氢气流量是 30 ml/min，空气流量是400 ml/min。

1.5 数据处理

试验数据基本处理采用Excel 2003，数据统计分析采用SAS进行方差分析，均值的多重比较采用Duncan's法进行。

2 结果与讨论

2.1 添加黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中脂肪酸组成的影响（见表1）

从表1中可以看出，添加黄花蒿乙醇提取物有增加 C12： 0、C14： 0、C14： 1、C16： 1、C18： 2 和 CLA脂肪酸含量的趋势。其中三个黄花蒿乙醇提取物组显著增加了乳腺上皮细胞中CLA的含量（P＜0.05）；10 mg/l组显著增加了C16： 1 的含量（P＜0.05）；5 mg/l组显著增加了C18：2的含量（P＜0.05）。添加黄花蒿乙醇提取物有降低 C16： 0、C18： 0、t9C18： 1 、c9C18： 1 和t11C18：1脂肪酸含量的趋势，其中2.5 mg/l组显著降低了 C18： 0的含量（P＜0.05）；5 mg/l组显著降低了t9C18:1的含量（P＜0.05）；5 mg/l和 10 mg/l组显著降低了t11C18： 1脂肪酸的含量（P＜0.05）。

表1 添加黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中脂肪酸组成的影响

本试验是直接在乳腺培养细胞中添加黄花蒿乙醇提取物的冻干粉，研究结果表明添加黄花蒿乙醇提取物显著增加了CLA含量，三个处理组增加CLA的顺序依次是：5 mg/l＞10 mg/l＞2.5 mg/l，而添加黄花蒿乙醇提取物均降低了t11C18：1的含量，降幅顺序依次是：5 mg/l＞10 mg/l＞2.5 mg/l。乳中 CLA 主要是通过乳腺组织中硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD把t11C18：1作为反应底物，在其C-9的位置上脱氢去饱和而生成CLA(Bauman和Griinari,2003)。本试验5 mg/l组的CLA含量最高，而其t11C18：1含量也最低，说明乳腺细胞中的t11C18：1去饱和生成了CLA而减少了自身的含量，而2.5 mg/l组CLA含量最低，但其t11C18：1含量相比较其它两个处理组却最高，说明2.5 mg/l组内的t11C18：1去饱和作用也少。但总体而言，三个处理组均增加了乳腺细胞中CLA的含量，这暗示了奶牛乳腺组织培养中添加黄花蒿乙醇提取物有增加SCD酶活性的趋势。本试验与王丽芳（2010）奶山羊试验结果相反的原因可能是因为奶牛与奶山羊品种不同，或者是因为奶山羊是在日粮中添加黄花蒿乙醇提取物后对乳腺中SCD酶活性的影响，黄花蒿提取物经过瘤胃、血液到达乳腺中的成分和本试验直接添加到乳腺中是有区别的。

2.2 菊科植物黄花蒿提取物对乳腺细胞中SCD酶去饱和酶指数的影响（见表2）

从表2中可以看出，添加黄花蒿提取物的三个处理组4个SCD酶去饱和酶指数均高于对照组，表明添加黄花蒿提取物增加了奶牛乳腺上皮细胞中SCD酶的活力，这与上面添加黄花蒿提取物增加奶牛乳腺上皮细胞中CLA含量的结果相一致。

表2 黄花蒿提取物对乳腺细胞中SCD酶去饱和酶指数的影响

SCD酶去饱和酶指数（SCD酶作用的脂肪酸产物/SCD酶作用的脂肪酸底物）可以反应SCD酶活力的高低（Baumgard等，2002）。乳腺中SCD酶有4个主要的作 用产物：C14： 1、C16： 1、c9C18： 1 和 c9,t11-CLA，其相应的底物是 C14： 0、C16： 0 、C18： 0和VA。

3 结论

添加黄花蒿提取物显著增加了奶牛乳腺上皮细胞中CLA的含量（P＜0.05），可能的原因是黄花蒿提取物增加了SCD酶的活性。

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[4]Bauman D E,J.M.Griinari.Nutritional regulation of milk fat synthesis[J].Annu.Rev.Nutr.,2003,23:203-227.

[5]王丽芳.添加菊科植物黄花蒿提取物对奶山羊乳中CLA含量影响及机理研究[D].内蒙古农业大学,2010.

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