天蚕壮阳散对肾阳虚证小鼠附睾精子膜GPC含量的影响※

刘朝圣 曾 顺

1.湖南中医药大学,长沙410208 2.湖南省浏阳市中医院

男性生殖健康的关键问题是精子质量。现代医学研究表明,附睾对精子的成熟、储运与衰变处理都有十分重要的影响。附睾是精子成熟的管内环境,其分泌参与精子成熟的因子有肉毒碱、α-糖苷酶、甘油-3-磷酸胆碱(GPC)及唾液酸(SA),在精子的成熟、获能、精卵识别及受精等过程中起着重要作用,它们反映了附睾的重要功能,是附睾的功能性指标。本文通过观测天蚕壮阳散对肾阳虚证雄性小鼠附睾功能性指标精子膜甘油-3-磷酸胆碱的变化,探讨温补肾阳法对雄性小鼠附睾功能影响的现代医学机制。

一般资料

实验动物:普通级健康雄性昆明种小鼠80只,日龄50天,体质量17～22g,室温 16℃～20℃,湿度 65%～70%,自由饮水进食(以上均由湖南中医药大学实验动物中心提供)。

药液制备:天蚕壮阳散由雄天蚕、熟地黄、枸杞子按10∶8∶7的比例组成。由湖南中医药大学第一附属医院中药房按上述比例购取生药材250g,先加蒸馏水浸泡40min,一煎加药材量的 6倍水,沸腾后煎30min;二煎加药材量的4倍水,沸腾后煎20min,过滤,两煎所得滤液混合后干燥浓缩至1∶1(即1ml药液相当于1g生药);分装于500ml广口试剂瓶中4℃冰箱中保存备用。

主要试剂:氢化可的松注射液,批号:20040603;规格:10mg/2ml;天津药业集团新郑股份有限公司生产。男宝胶囊,批号:20071101;规格:0.3g/粒:吉林省利华制药有限公司生产,将男宝胶囊用温开水按1∶10的比例(即1ml药液含男宝胶囊0.1g)溶成药液,分装于500ml广口试剂瓶中4℃冰箱中保存备用。

实验方法

肾阳虚小鼠模型造模方法[1]:待小鼠适应环境后,从80只小鼠中用随机数字表法抽取20只作为正常组,余下60只作为造模组。造模组均臀部肌肉注射氢化可的松注射液25mg/kg◦d,每日 1次,连续15天。根据肾阳虚症状的客观指标[2]:怕冷、畏寒喜暖、四肢不温、小便清长、精神委靡、消瘦等确定模型成功与否。

实验分组:造模成功后将造模组60只小鼠先按体重大小分层,再采用随机数字表法随机分为3组,即天蚕壮阳散治疗组(简称天蚕组)、男宝治疗组(简称男宝组)、模型组,每组20只。

给药方法与药量:造模成功后开始给药,正常对照组、模型组经灌胃给蒸馏水,天蚕组、男宝组灌胃给相应药物。给药剂量按动物每公斤体重占人体表面积的比值计算,连续灌胃 28天,每日 2次,上午 8:30～9:30、下午4:00～5:00各 1次。

精子膜GPC含量的测定:用断脊法处死小鼠,取出睾丸和附睾组织,仔细分离后弃去睾丸和附睾外的结缔组织及血管,进行组织匀浆,置于恒温水浴箱中反应15min,制作标本。按照试剂盒要求操作。取出试剂盒,于室温20℃～25℃放置15～30min。实验过程应在室温20℃～25℃内进行。取出酶标板,按照标准品的次序分别加入50μ l的标准品溶液于空白微孔中;空白微孔中加入 50μ l的样品,空白对照加入 50μ l的蒸馏水;在样品孔中加入10μ l的生物素溶液(不含空白对照孔);如果样品确需稀释,必须是在样品及生物素混匀的状态下,一起等比例稀释在各孔中加入100μ l的酶标记溶液;将酶标板用封口胶密封后,37℃孵育反应1h(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度);充分清洗酶标板3～5次,保持各孔有充足的水压(浓缩洗涤液以1∶100的比例与蒸馏水稀释);酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干;各孔加入显色剂 A、B液各 50μ l(不含空白对照孔);20℃～25℃下避光反应 15min;各孔加入50μ l终止液,终止反应。30min内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值;OD值为纵坐标(Y轴),以标准品的浓度为横坐标(X轴),绘制标准曲线图;根据样品的OD值查找对应的浓度范围。

结果

各组精子膜GPC含量变化见表1。

表1 各组精子膜GPC含量变化(±s)

表1 各组精子膜GPC含量变化(±s)

注:与模型组比较,＊P＜0.01;**P＜0.01;△P＜0.05

组别 例数 GPC(μ g∕ml)天蚕组 10 2.93±1.20＊男宝组 10 2.76±1.09＊＊正常组 10 3.24±1.83△模型组 10 4.62±1.27

模型组GPC含量与天蚕组、男宝组比较,差异有显著性意义(P＜0.01),与正常组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);天蚕组、男宝组及正常组之间差异没有统计学意义。

讨论

甘油-3-磷酸胆碱(GPC)为一种磷脂类代谢产物,它广泛存在于哺乳类动物的各种组织和器官,尤其是在雄性生殖系统的附睾组织及分泌液中具有相当高的含量。国外的一些研究对精浆中GPC浓度进行测定后认为,精浆GPC浓度与附睾功能密切相关[3,4]。精子膜GPC对精子在附睾内转运过程中的主要作用是作为形成精子膜液态镶嵌结构的重要组分,维持膜结构的完整性。精子膜磷脂部分中磷脂酰胆碱(PC)是一种主要成分[5],附睾液中磷脂酶 A又具有较高的活性[6],该酶能分解精子膜上GPC为PC与甘油,而甘油可作为精子代谢过程中的一种能源。精子膜GPC含量越低,精子越趋于成熟,精子活动率、活动力则趋正常。

中医认为,男性精液质量低下大多属“肾阳虚”范畴。故温阳益肾法一直是历代医家用于治疗肾阳虚证的主要方法。天蚕壮阳散由雄天蚕、熟地黄、枸杞子等组成。方中以血肉之品雄天蚕(雄蚕蛾中之佳品)为君,以温肾壮阳,然药性较之桂、附之类更加平稳;熟地黄补肾填精;枸杞子补血养肝,盖因精血同源,气血充足则肾精化生有源,二者共为臣。全方壮阳与滋阴并举,其功在于既温而又不燥,温肾无燥热之偏,益精无凝滞之嫌,尤以温肾阳、益肾精、平衡阴阳见长,使阳得阴助而生化无穷,阴得阳升而泉源不竭,终达阴阳调和之效。

本实验表明,天蚕壮阳散可降低精子膜GPC含量。提示温肾补阳中药可通过干扰附睾的生理功能,影响GPC正常分泌,进而影响精子在附睾中的成熟,这为天蚕壮阳散治疗男性不育提供了实验依据。

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