水体硝化菌剂保存方法的研究

2010-06-04，，

化学与生物工程 2010年1期

，，

(1.辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁抚顺 113001；2.中国石化抚顺石油化工研究院，辽宁抚顺 113001)

菌种保藏的主要目的在于能在较长时间内保持菌种的生存，保持菌种在遗传、形态和生理上的稳定性[6]。同时，还要保持菌种的物种独立性，使其免受其它微生物的侵染，保持纯培养状态[7]。其原理主要是根据微生物的生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降至最低程度或处于休眠状态，使菌株很少发生突变，以达到保持纯种的目的[8]。

菌种保存的方法有很多，如斜面保存、液体石蜡保存、冷冻干燥保存、液氮超低温保存、干燥保存等等。由于硝化菌的降解能力和保藏能力是影响其商品化的两个重要因素[9]，所以本实验旨在寻找硝化菌的最佳保存方法。

1 实验

1.1 仪器

可见分光光度计,韩国新科仪器制造公司;恒温水浴锅,北京顺杰欣隆科技有限公司;电子分析天平,德国天平仪器公司。

1.2 硝化作用原理

在好氧条件下，通过亚硝化菌和硝化菌的作用，将氨氮氧化成亚硝酸盐和硝酸盐的过程,称为生物硝化作用。生物硝化的反应过程为：

由上式可知:(1) 在硝化过程中，1 g氨氮转化为硝酸盐氮时需氧4.57 g；(2)硝化过程中释放出H+，将消耗废水中的碱度，每氧化1 g氨氮，将消耗碱度(以CaCO3计)7.1 g。

影响硝化过程的主要因素有：(1)pH值，当pH值为8.0～8.4时(20℃)，硝化作用速度最快。硝化过程中pH值在7.5以上。(2)温度，温度高时硝化速度快。亚硝化菌的最适宜水温为35℃，在15℃以下其活性急剧降低，故水温不宜低于15℃。

1.3 硝化活性评价培养基(NBM，氨氮浓度150 mg·L-1)

培养基组成：(NH4)2SO42.1 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，CaCl20.3 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1， FeSO417 mg·L-1，EDTA 8 mg·L-1。

1.4 氨氮浓度的测定

氨氮浓度测定采用纳氏比色法，参照GB/T 7479-1987。

1.5 比硝化活性(NA)的测定

比硝化活性(NA， g·kg-1·h-1)定义为单位质量(kg)硝化菌在单位时间(h)内消耗的氨氮质量(g)。

取1 g新鲜培养或保存后的硝化菌群浓缩液接种于300 mL NBM培养基中，28℃培养，反应器有效体积为500 mL，气升式搅拌，通气量为2 L·min-1，分别在接种前和培养48 h后测定反应体系中的氨氮浓度( mg·L-1)，记为c0和c1，按式(1)计算NA。

(1)

1.6 硝化活性保持率(RNA)的测定

RNA指保存后硝化菌的硝化活性(NA1)占新培养硝化菌的硝化活性(NA0)的百分比，见式(2)。

(2)

2 结果与讨论

2.1 氨氮浓度标准曲线

按照GB/T7479-1987方法测定反应液的OD值，以氨氮浓度(ca， mg·L-1)为横坐标、吸光度(OD)值为纵坐标绘制标准曲线，见图1，拟合回归方程为OD=4.957ca-0.011。

图1 OD值与氨氮浓度之间的关系

2.2 室温保存的硝化菌活性考察

取新鲜培养和室温保存7 d、21 d、28 d、42 d的硝化菌群浓缩液，测定比硝化活性，结果见图2。

图2 硝化菌活性随室温保存时间变化趋势

从图2可知，随着保存时间的延长，硝化菌的活性急剧下降，新鲜培养和室温保存7 d、21 d、28 d、42 d的硝化菌的比硝化活性(g·kg-1·h-1)分别为0.46、0.38、0.25、0.19、0.03，平均每天降低0.0101 g·kg-1·h-1，半衰期为22.45 d。

由于在常温下保存硝化菌的活性没有受到抑制，而且硝化菌在保存之前经过浓缩，菌体的密度相对较高，导致了在保存过程中随着时间延长，硝化菌严重缺氧致死。另外，由于实验室培养的硝化菌并非纯的自养硝化菌，而是一个以自养硝化菌占优势的菌群，菌群中还存在少量反硝化菌。反硝化菌比较适合在无氧的条件下生长，而且属于异养菌，生长时需要碳源，因此在保存过程中随着体系中的氧气消耗殆尽，反硝化菌对死掉的硝化菌起到了腐败的作用，所以在室温保存一个月左右的时候，整个保存体系会逐渐变黑，而且气味发臭，这也是进一步加速菌群硝化活性降低的原因之一。由此可见，室温保藏硝化菌的方法只适合硝化菌的短期保存。

2.3 不同温度保存的硝化菌活性考察

由于室温仅适合短期保存硝化菌，因此考察了其它温度条件下保存硝化菌的活性。取新培养和分别在4℃、20℃、30℃、35℃条件下保存28 d的硝化菌群浓缩液，测定比硝化活性，计算硝化活性保持率，结果见图3。

图3 不同温度保存的硝化菌活性保持率

从图3可知，4℃、20℃、30℃和35℃保存28 d的硝化菌的活性保持率分别为58.59%、52.97%、34.89%和8.63%。由此可见，在不结冰的前提下，20℃以下保存硝化菌活性相对损失较小，20℃以上则不利于长期保存，4℃条件最好。任杰等[9]研究发现在不同温度下保存的硝化菌随着保藏温度的升高，其衰弱指数逐渐增大，半衰期逐渐缩短，这与本实验的结果相符。

2.4 4℃冷藏的硝化细菌活性考察

取新培养和冰箱中4℃冷藏28 d、42 d、90 d和180 d的硝化菌群浓缩液，测定比硝化活性，结果见图4。

图4 硝化菌活性随4℃保存时间变化趋势

从图4可知，随着保存时间的延长，硝化菌的活性逐渐下降，但是与室温保存相比，活性下降的速率较慢。新培养和冰箱中4℃冷藏28 d、42 d、90 d和180 d的硝化菌群浓缩液的比硝化活性(g·kg-1·h-1)分别为0.46、0.27、0.18、0.10和0.02，半衰期为36.68 d。

由于硝化菌在4℃条件下代谢活动降低或接近于停止，维持生命所需的氧气较少或甚至不需要，而且反硝化菌等杂菌在这种条件下不能生长，因此4℃条件保存时间比室温更长，比较适合用于硝化菌的中期(1～2个月)保存。

2.5 加培养基保存的硝化菌活性考察

考察了保存体系中加入NBM培养基对保持硝化菌活性的影响，取新培养和在4℃与室温条件下加培养基或不加培养基保存28 d的硝化菌群浓缩液，测定比硝化活性，计算硝化活性保持率，结果见图5。

图5 保存体系加培养基对保持硝化菌活性的影响

从图5可知，无论室温或4℃保存，体系中加入NBM培养基都有利于硝化活性的保持。室温下未加培养基、室温下加培养基、4℃未加培养基和4℃加培养基保存28 d的硝化菌群的硝化活性保持率分别为40.32%、55.94%、58.59%和67.23%。可见加培养基后，室温和4℃保存的活性保持率分别提高了15.62%和8.64%。因此可以推测，加培养基后室温和4℃保存的半衰期将分别向后推迟15.62%和8.64%。加培养基比不加培养基能保持更多的硝化活性，是因为培养基中的营养成分为硝化菌提供了代谢所需的必要物质保障，而加培养基条件下常温保存和4℃保存相比，硝化活性保持率提高得更多(分别为15.62%和8.64%)，这可能是因为常温条件下硝化菌的代谢活动远远大于4℃条件所致。

2.6 -20℃冻存的硝化细菌活性考察

2.6.1 选择冻存保护剂

考察了甘油和二甲基亚砜(DMSO)为保护剂冻存硝化菌群保持活性的效果。甘油和DMSO加入量(质量比)为10%，保存温度为-20℃，保存时间为28 d。取新培养和保存后的硝化菌群浓缩液，测定比硝化活性，结果见图6。

图6 甘油和DMSO为保护剂对冻存后硝化菌活性的影响

从图6可看出，以甘油或DMSO为保护剂，-20℃条件冻存28 d后，比硝化活性(g·kg-1·h-1)分别为0.45和0.42，比新培养的硝化菌群分别仅降低2.2%和8.7%。可见，甘油和DMSO作为保护剂都能保持硝化菌的活性，其中甘油效果更好。甘油和DMSO能作为硝化菌群冻存保护剂的原因可能是因为它们可以渗透到细胞内，使得细胞脱水而保护细胞不被冻裂。

2.6.2 硝化活性随冻存时间变化的趋势

以甘油为保护剂，-20℃条件冻存的硝化菌群分别于1、4、8、12、18、24和36个月后取样分析其硝化活性，见图7。

NA=0.4533 e-0.0213t

(3)

图7 硝化活性随冻存时间变化的趋势

从图7可知，随着冻存时间的延长，硝化活性呈递减趋势[式(3)]，但与室温和4℃保存的硝化细菌活性相比，降低的速率相对较慢，其半衰期为31.85个月，约955.5 d。由于保护剂甘油的存在使得硝化菌在结冻时免于因细胞内水分结冰造成细胞裂解，同时又因为处在-20℃的低温环境，细胞停止了一切代谢活动，不会因为细胞密度、营养等因素而导致细胞死亡，能够很好地保持硝化菌的生命特征，从而维持其硝化活性。因此，相比室温和4℃保存，-20℃冻存适合于硝化菌的长期(2～3年)保存。