藻蓝蛋白对2型糖尿病大鼠胰腺组织iNOS表达的影响

马璇 刘琳 张蕊 刘吉东 沈卫

糖尿病与机体内自由基的增多以及抗氧化防御系统功能紊乱有关，氧化应激被认为是糖尿病各种并发症的共同发病途径[1]。藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)是一种重要的色素蛋白，普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合，是螺旋藻(spiru lina)细胞中起重要光合作用的天然色素，在螺旋藻中的含量高达10%～20%[2]。研究表明，藻蓝蛋白具有促进动物细胞的再生，清除自由基、抑制肿瘤、抗辐射、抗过敏、抗疲劳、抗病毒、增强免疫力和抗炎的作用[3]。目前，对藻蓝蛋白的研究开发集中于抗肿瘤、神经保护作用等方面，针对糖尿病治疗作用及其机制鲜有研究，本实验利用2型糖尿病大鼠模型，观察藻蓝蛋白的抗氧化作用，探索其对2型糖尿病的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型

健康雄性W is t a r大鼠3 2只，鼠龄1个月，体重1 3 0 g～1 5 0 g，由青岛市药检所实验动物中心提供(SCXK(鲁)20030010)。动物均于实验前置于实验室适应环境一周，自由饮食，室温(23±2)℃，自然光照，相对湿度50%～70%。随机分为正常对照组(8只)、模型组及药物干预组(24只)。正常对照组大鼠喂以普通饲料，其余喂以高糖高脂饲料(15%猪油、20%蔗糖、13%蛋黄粉、2%胆酸钠、50%普通饲料)饲养[4-5]，四周后禁食12h，以30mg/kg剂量一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)柠檬酸缓冲液，正常对照组大鼠同步注射等量的柠檬酸缓冲液。注射1周后剪尾取血，测空腹血糖，以血糖值≥7.0mmol/L为糖尿病模型建立成功。24只大鼠造模成功，将其随机分为模型组、藻蓝蛋白组、二甲双胍组各8只，其中模型组2只大鼠于实验第11周死亡。

1.2 干预措施

糖尿病模型成功后(实验第9周)开始干预治疗。藻蓝蛋白粉剂(藻蓝蛋白由中国科学院海洋研究所提供)暗室分装后-20℃保存，用前加蒸馏水稀释至浓度为10%的混悬液，按500m g/kg体重灌胃给药(藻蓝蛋白剂量由中国科学院海洋研究所推荐使用)，每天1次，连续10天；二甲双胍组同步给予二甲双胍(400m g/kg)，以蒸馏水稀释至8%浓度连续灌胃10天。正常对照组和糖尿病模型组同步给予等体积的生理盐水，连续灌胃10天。

1.3 血糖

各组动物分别在第1周末、第8周末、第10周末测空腹血糖(FBG)(mmol/L)。大鼠禁食12h后，次日早鼠尾静脉取血，用血糖仪(强生医疗器材有限公司，稳豪型)测定空腹血糖。

1.4 免疫组化染色

治疗结束后(11周初)，各组大鼠颈椎脱臼处死，迅速取胰腺，4℃生理盐水冲洗干净后10%甲醛固定24h，蒸馏水浸泡4h后。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，LEICA 2135石蜡切片机连续切片，厚度5um，每隔20片取1片，每个标本取6片，分别裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，室温保存备用。iNOS亲和纯化抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒，均由武汉博士德生物司提供。取上述切片常规脱蜡至水，严格按试剂盒说明书操作，DAB显色，光镜下特异性染色为片状棕黄色粗颗粒。部分切片不加一抗以0.1mol/L PBS替代染色，不出现阳性着色。光学显微镜(400倍)下，每张切片随机选择4个视野，分别计数每个视野内100个胰岛细胞中iNOS的阳性细胞数，以各组的阳性细胞数进行比较。

1.5 统计学处理

实验数据以SPSS11.5统计软件包处理，各组数据以均数±标准差(±s)表示；组间比较用方差分析，q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

造模成功后，糖尿病大鼠体重较正常组明显降低(P＜0.05)。经过治疗后，藻蓝蛋白组和二甲双胍组大鼠体重较模型组显著增加(P＜0.05)，且两组大鼠多饮、多食、多尿的情况有所改善，表明藻蓝蛋白和二甲双胍对糖尿病症状改善有一定的治疗效果(表1)。

2.2 空腹血糖

STZ造模后，模型组、藻蓝蛋白组、二甲双胍组大鼠空腹血糖与正常组比较明显升高(P＜0.05)。经干预治疗后，藻蓝蛋白组、二甲双胍组大鼠空腹血糖与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)(表2)。

2.3 组织病理

正常组大鼠的胰岛呈圆形或椭圆形的细胞团，胰岛内细胞数量较多，细胞边界清晰，排列整齐，分布均匀；糖尿病对照组大鼠的胰岛内细胞数量明显减少，细胞边界不清，排列紊乱；部分细胞肿胀、皱缩、坏死、核缺失；藻蓝蛋白组和二甲双胍组大鼠胰岛细胞病变减轻，胰岛细胞团形状较规则，与模型组有较大改善，但与正常组相比仍有差距(图1)。

2.4 iNOS表达

正常组大鼠胰岛细胞iNOS呈弱表达，糖尿病模型组大鼠(2只死亡)胰岛细胞iNOS表达较正常组增强(P＜0.05)，呈棕黄色，着色部位主要在胰岛细胞胞浆。藻蓝蛋白组和二甲双胍组大鼠胰岛细胞iNOS表达较糖尿病组显著降低(P＜0.05)，着色较浅，但藻蓝蛋白组和二甲双胍组之间无显著性差异(P＞0.05)。见表3和图2。

3 讨论

Ceriello[6]等认为，氧化应激是胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同发病机制，机体因遭受各种有害刺激时，体内氧自由基产生过多；清除能力降低，当氧化系统和抗氧化系统失衡，就会导致机体组织和功能损伤[7-8]。NO是具有许多生物活性的自由基，是重要的信使分子和效应分子，但是其过量产生会发挥极强的细胞毒性作用。

在糖尿病早期，由于肾小球或视网膜内皮细胞产生NO增多，加上糖尿病患者普遍存在的脂毒性，非饱和游离脂肪酸上调诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，产生过量的NO，过量的NO产生大量的过硝酸根离子(ONOO-)和OH-等自由基，损伤β细胞的结构和功能[9]。同时，增高的NO促进胰岛素分泌，加之胰岛素抵抗的加重及持续高血压，刺激β细胞处于持续高分泌状态，促进β细胞衰退，更加重了糖尿病的进展。另外，动物实验发现，在所有组织中胰岛内的具有抗氧化能力的超氧化物歧化酶(SOD)活性最低，胰岛又是富含膜结构的组织，极易受自由基的攻击，以上特性使胰岛细胞受NO产生的氧化损伤作用增强。一氧化氮合酶(NOS)抑制剂可明显降低BB大鼠糖尿病的发病率，进一步说明了NO在糖尿病中的重要作用。但是，由于NO半衰期极短，在组织中直接测定非常困难，Kolodziejska等[10]研究表明，在病理状态下直接检测组织中iNOS可客观反映组织中NO的含量。

表1 各组动物体重的变化(±s)(单位：g)

表1 各组动物体重的变化(±s)(单位：g)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别 例数 1周 造模后(8周) 治疗后(10周)正常组 8 145.25±5.01 347.88±21.50 390.38±28.54模型组 8 146.75±4.56 269.00±23.77 264.00±24.33△藻蓝蛋白组 8 145.50±3.96 261.00±17.70 287.38±13.38△二甲双胍组 8 148.38±3.46 260.13±26.24 288.25±21.99△

表2 各组大鼠空腹血糖的比较(±s)(单位：mmol/L)

表2 各组大鼠空腹血糖的比较(±s)(单位：mmol/L)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别 例数 剂量(mg/kg) 造模后(8周) 治疗后(10周)正常组 8 — 3.48±0.50 3.91±0.71模型组 8 — 9.15±3.20* 8.94±1.90*藻蓝蛋白组 8 500 9.75±1.58* 7.05±0.87△二甲双胍组 8 400 9.88±2.06* 5.74±1.32△

表3 各组不同脏器iNOS阳性细胞数(±s)

表3 各组不同脏器iNOS阳性细胞数(±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别 N 胰腺正常组 8 3.75±1.26模型组 6 18.00±1.63藻蓝蛋白组 8 8.00±1.63 △二甲双胍组 8 10.50±2.52 △

图1 大鼠胰腺细胞，HE×200

二甲双胍具有抗氧化特性，在大动脉内皮细胞中，二甲双胍可以通过降低NAD(P)H氧化酶或线粒体呼吸链的活性而减少ROS产生[11]。Romay等[12]研究表明，藻蓝蛋白可以清除烷基、羟基、过氧基，可以抑制由Fe2+、坏血酸致微粒体脂质过氧化，其抗氧化作用与抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)及NO产生有关。Bhat等[13]认为，藻蓝蛋白还可以清除ONOO-，且其清除氧自由基作用与其发色团有关。

图2 大鼠胰岛细胞iNOS表达，DAB×400

本实验表明，糖尿病大鼠模型成功后血糖明显升高。经过两周治疗，藻蓝蛋白组和二甲双胍组血糖均有所下降，二甲双胍组、藻蓝蛋白组与模型组相比同样具有统计学意义，说明藻蓝蛋白具有降低血糖的作用。另外，本实验研究证明，经藻蓝蛋白治疗后的糖尿病大鼠胰岛细胞中的iNOS表达，无论是着色程度还是阳性细胞数量上较模型组都明显呈现弱表达，着色部分主要位于胞浆。结合藻蓝蛋白干预组与模型组病理形态学对比，推测，藻蓝蛋白很可能从抗氧化方面具有一定的治疗2型糖尿病的作用。Bottino等[14]通过分离纯化胰岛细胞，在体外早期应用抗氧化剂干预胰岛细胞，也发现阻断氧化应激的反应过程可明显降低胰岛细胞的损伤，并可促进胰岛细胞的增殖，为2型糖尿病的早期诊断和干预提供了一种新的思路。另外，二甲双胍与藻蓝蛋白均具有降糖、抑制iNOS表达、改善胰岛细胞结构的作用，但藻蓝蛋白作用靶点是否与二甲双胍一致，其确切的作用机制尚需探索。藻蓝蛋白有望成为治疗2型糖尿病的候选药物，其具体的作用机制、剂量、疗程有待进一步研究。

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