荧光法测定醛糖还原酶活性的优化

王俊杰 方会龙 段小毛 肖和平 谷 娟 李 玲 欧阳冬生

(中南大学临床药理研究所,湖南 长沙 410003)

醛糖还原酶(Aldose Reductase,AR)是葡萄糖代谢多元醇通路的限速酶,高血糖可激活AR,使葡萄糖经多元醇通路的代谢增强,造成山梨醇在细胞内的蓄积和还原剂如还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的缺失,导致细胞膜的结构和功能受损而干扰细胞的正常代谢。动物和临床实验均提示,高血糖激活AR是糖尿病并发症的主要发病机制之一〔1〕。最新研究发现 AR还在心肌缺血〔2〕及内毒素引起的休克反应〔3〕中发挥着重要作用。因此,测定红细胞AR活性,对研究AR与相关疾病发病机制的关系具有重要意义。目前测定 AR活性有荧光法和比色法。红细胞 AR活性测定多采用荧光法〔4〕,其原理为 NADP与强碱作用产生荧光信号,其强度与NADP的浓度成正比,咪唑可保护荧光的稳定性,当定量且过量的 NADPH存在时,以 DL-甘油醛为底物,可通过测定NADP的生成或NADPH的减少来反映 AR活性。新近有研究显示 NADP生成法灵敏度和重复性更好〔5〕,为此,我们对该方法进行了优化。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 雄性 10周龄 SD大鼠 20只,由中南大学动物实验中心提供,随机分成 2组:对照组和糖尿病组。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 NADPH(纯度 ＞98%,ROTH公司),NADP(纯度 ＞90%,ROTH公司),DL-甘油醛(Wako公司),链脲佐菌素(STZ,Sigma公司),其他试剂均为国产分析纯。荧光分光光度计(日本产岛津 RF-5000),京都血糖仪(日本第一科学株式会社)。

1.2.2 大鼠糖尿病模型的复制 大鼠适应性喂养 3 d,禁食12 h,糖尿病组按 5.5 ml/kg体重单次腹腔注射 STZ溶液 (STZ用 0.1 mol/L pH 4.2的柠檬酸缓冲液配成 10 mg/ml的溶液),3 d后尾静脉采血随机测血糖≥13.5 mmol/L者为糖尿病大鼠,对照组注射等量柠檬酸缓冲液。饲养期间所有大鼠自由饮水进食。4 w后眼眶采血,血糖仪测定血糖。

1.2.3 制备裂解红细胞 4 w后,眼眶采血,取肝素抗凝血1 ml,3 000 r/min×10 min分离红细胞,然后加 4倍体积 4℃预冷的生理盐水,3 000r/min×10 min×3次离心洗涤红细胞,按照50μl/支分装 (一支实验管,其余备用),-20℃冻存。取冻存红细胞加 200μl 10 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0),振荡溶解10 min,3 000r/min×10 min,去沉淀。

1.2.4 AR活性测定反应体系 每份样品一式三份,冰上操作,反应体系(终浓度):135 mmol/L PBS,100 mmol/L硫酸铵,0.04 mmol/L DL-甘油醛,150 μmol/L NADPH,5 μl红细胞溶血液,总体积 200μl。实验管加上述所有试剂,空白管以去离子水代替 NADPH。加入 DL-甘油醛后立即 37℃水浴反应。

1.2.5 终止反应 5 min后,将样本同时放入冰浴中,加入600μl 0.5mol/L HCl后 60℃水浴 15 min来终止反应并破坏反应剩余的 NADPH。冰浴冷却后加入 250μl 6%高氯酸3 000 r/min×10 min离心沉淀血红蛋白,吸取上清 1 ml,-20℃冻存。

1.2.6 荧光值测定 加入 2 ml 6 mol/L NaOH(内含10 mmol/L咪唑)37℃水浴 5 min激发 NADP产生荧光,Ex 360nm/Em460 nm测定荧光强度。

1.2.7 血红蛋白含量测定〔6〕用高铁氰化血红蛋白法。实验管加稀释液 3 ml,红细胞溶血液 12μl,空白管以去离子水代替红细胞溶血液,混匀,静置 5 min,以空白管调零测实验管在540nm的吸光度值,计算血红蛋白含量 Hb(g/L)=OD540×367.7。每份样品平行做三份取均值。

1.2.8 绘制标准曲线并计算 AR活性 反应体系与条件同上,去离子水代替红细胞溶血液,NADP(0～1 000μmol/L)代替 NADPH,以NADP浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标做标准曲线,求回归方程。由方程求得 NADP生成量,以每分钟产生1μmol NADP为 1个酶活性单位(U),计算 AR活性。

1.2.9 血红蛋白对AR活性测量值的影响 ①按照以上实验方法分别测定在加入 2.5、4、5、6、10μl同一红细胞溶血液的情况下激发的荧光强度;②在终止反应后的NADP溶液中未加入250μl 6%高氯酸沉淀血红蛋白,然后测定激发的荧光强度。

1.2.10 样本的保存周期 以同一溶血液为标本,测定反应体系生成的 NADP溶液在 -20℃冻存 0、4、24 h,1、2、4 w后的NADP激发的荧光强度。

1.2.11 同一红细胞溶血液激发荧光的水浴反应时间对荧光强度的影响 ①37℃水浴 5 min后测量 NADP产生的荧光值;②37℃水浴 30 min后测量 NADP产生的荧光值;③37℃水浴60 min后测量 NADP产生的荧光值。

1.3 统计学分析 实验结果用x±s表示,两样本均数比较用t检验,多样本均数比较(成组设计)用单因素方差分析。统计分析采用 SPSS12.0统计软件包。

2 结 果

2.1 标准曲线与回归方程 NADP标准曲线的回归方程:荧光强度 =2.828+1.419×NADP浓度,则 NADP浓度 =(荧光强度-2.828)/1.419。

2.2 血红蛋白对AR活性测量值的影响 在未去除血红蛋白的条件下,红细胞溶血液在 2.5～10μl的范围,荧光强度随红细胞血红蛋白量的增加而降低;在终止反应后的 NADP溶液中加入 250μl 6%高氯酸沉淀血红蛋白,荧光强度随红细胞溶血液的含量升高而升高,提示红细胞对荧光测量值有较大干扰。红细胞溶血液 2.5、4、5、6、10μl各组未去除血红蛋白测定的荧光值均低于去除血红蛋白测定的荧光值(P＜0.05),见表 1。

表1 红细胞溶血液在去除和未去除血红蛋白条件下激发的荧光强度(x±s)

2.3 样本的保存周期 -20℃冻存 4、24 h,1、2、4 w后的NADP溶液测定的荧光强度分别是:45.2±1.7,44.2±1.3,45.4±1.9,44.1±2.1,44.4±2.3与对照组(44.9±1.2)比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 激发荧光的水浴反应时间对荧光强度的影响 生成的NADP溶液加入含咪唑的 NaOH后,在 37℃水浴分别放置 5、30、60 min激发荧光值,各组间总体均数差异均有统计学意义(P＜0.05),各组间变异系数的差异无统计学意义(P＞0.05),见表 2。

表2 激发荧光的不同水浴时间测量的荧光强度(x±s)

2.5 各组大鼠血糖和红细胞AR活性比较 糖尿病大鼠造模4 w后血糖为(22.72±3.42)mmol/L与对照组血糖(6.25±1.04)mmol/L比较显著升高(P＜0.05)。糖尿病大鼠 AR活性(5.64±2.28)U/mg较对照组(1.45±0.98)U/mg显著升高(P＜0.05)。

3 讨 论

红细胞 AR活性测定常采用荧光法,本实验中采用的是NADP生成荧光法,其测定步骤为:一定时间内的反应,终止反应,激发荧光并测定荧光值,根据标准曲线、荧光值和蛋白含量计算 AR活性。体外测定AR活性的原理是,AR使底物DL-甘油醛转化为 DL-甘油酸的同时,NADPH被氧化成 NADP,NADP可进一步与强碱作用产生荧光,荧光强度与其浓度成正比,加入咪唑可以在一定时间内防止荧光强度衰减。因此通过测定NADP生成可以反映AR的活性。

本研究结果显示,红细胞溶血液在 2.5～10μl范围内,未去除血红蛋白测定的荧光值均低于去除血红蛋白测定的荧光值,且随着红细胞溶血液的浓度增大,荧光值的差异也越大,提示血红蛋白对荧光值影响较大,推测可能是由于血红蛋白上的亚铁离子与 NADP发生氧化还原反应而减弱了荧光。终止反应后用 6%高氯酸沉淀血红蛋白可以避免荧光值的消减。

反应体系生成的 NADP溶液是否能长期保存目前未见报道,我们的研究结果发现,NADP溶液经过 4、24 h、1、2、4 w的贮存时间后激发荧光强度无统计学差异。建议实验可以分段进行,以提高效率,特别适合需要在别处使用荧光分光光度计的实验室。

目前测定红细胞 AR活性的方法中,激发荧光的水浴反应时间主要有 5、30、60min。结果显示,37℃水浴 5min荧光强度已接近最大值,5～60 min激发的荧光值逐渐增大。5～30 min比 30～60 min AR活性变化的趋势缓和,60 min的标准差高于5和 30 min,但变异系数的差异无统计学意义。但为提高实验效率,建议采用 37℃水浴 5 min的实验方案。

AR活性是通过 AR催化底物DL-甘油醛反应 5 min后辅酶的改变来计算的。加入底物DL-甘油醛开始计时,37℃水浴5 min加入HCl终止反应后停止计时。由于一次有多个样本需要终止反应。因此建议样本在 37℃水浴进行反应后,样本同时置于冰浴中再加入 HCl终止反应,可减小实验误差。

由于实验条件和方案的不一致,AR活性测量值会有差异,用优化后AR活性测定的NADP生成法能够准确反映糖尿病大鼠红细胞 AR活性的变化。

1 Yabe-Nishimura C.Aldose reductase in glucose toxicity:a potential target for the prevention of diabetes complications〔J〕.Pharmacol Rev,1998;50(1):21-33.

2 Kariserova K,Srivastava S,Hoetker JD.Redox activation of aldose reductase in the ischemic heart〔J〕.J Biol Chem,2006;281(22):15110-20.

3 Ramana KV,Willis MS,White MD,et al.Endotoxin-induced cardiomyopathy and systemic inflammation in mice is prevented by aldose reductase inhibition〔J〕.Circulation,2006;114(17):1838-46.

4 刘长山.糖尿病者红细胞醛糖还原酶测定的方法学探讨〔J〕.辽宁实用糖尿病杂志,2001;9(4):23-5.

5 张志华,叶 玲,刘建伟,等.荧光法动态观察糖尿病大鼠红细胞醛糖还原酶活性〔J〕.中国老年学杂志,2005;25(4):426-8.

6 葛荣正,李洪东,李秀兰,等.氰化高铁法测定血红蛋白应注意的几个问题〔J〕.中国卫生检验杂志,2001;11(4):105.