金樱子对糖尿病鼠肝氧化应激的影响

许金华 秦振启 周钰娟 罗玉平 张秋菊

金樱子(RosaLaevigataMickx)，又称为刺梨子、刺榆子，入药历史悠久。我们课题组研究发现，用含有金樱子的饲料喂养糖尿病大鼠后，血糖、血脂降低，并能减轻糖尿病时肾病的发生与发展［1］。本实验进一步研究金樱子抗氧化应激的作用机理，检测金樱子对实验性糖尿病大鼠肝脏的IKK/IκB/NF-κB信号通路中下游单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、核转录因子(NF-κB)表达的影响，为防治糖尿病提供新依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90只雄性SD大鼠购自南华大学实验动物部(许可证:SYXK(湘)2004-0011)，约2月龄，体重为(250 ±20)g，适应性饲养1周。

1.2 药品与试剂 金樱子干果购自衡阳市药材公司，去蒂和杂质，晒干，用电动粉碎机辗成粉末过筛去粗粒，按每只鼠每天40g鼠普通饲料加生药粉(5g/kg·bw·d)制成加药颗粒饲料。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司;MCP-1抗体、NF-κB抗体购自武汉博士得生物工程公司;其余试剂均为国产分析纯试剂。高糖高脂饲料为蔗糖10%、猪油10%，奶粉7%、鸡蛋10%、普通饲料63%。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立 按体重随机取50只雄性SD大鼠，禁食不禁水12h后，参照洪丽莉等［2，3］的方法并加以改进建立糖尿病模型:按25mg/kg·bw剂量空腹腹腔注射1%的链脲佐菌素(STZ)溶液。STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH4.2)配制，10min内用完。饲喂高糖高脂饲料，自由饮水。注射STZ后，于第3、6、15天禁食不禁水过夜后测血糖，3次血糖值均大于11.3mmol/L者为造模成功。从中挑选40只按体重随机分为两组:糖尿病模型组(模型组)和金樱子干预组(干预组)，每组20只。未注射STZ的40只雄性SD大鼠，按体重随机分为正常对照组(正常组)和金樱子对照组(对照组)，每组20只，腹腔内注射等量枸橼酸钠溶液。

糖尿病模型组饲喂高糖高脂饲料，金樱子干预组饲喂高糖高脂加金樱子的饲料，正常对照组饲喂普通饲料，金樱子对照组饲喂加金樱子的普通饲料。连续给药24周。24周后按33mg/kg·bw的剂量腹腔注射水合氯醛麻醉处死大鼠，取部分肝组织用消毒的冰冷生理盐水洗净血液，立即入-80℃冰箱保存待测MCP-1、NF-κB的蛋白表达。

1.3.2 检测MCP-1、NF-κB的蛋白表达 免疫组化SP法:将石蜡切片常规脱蜡，水化后，用PBS冲洗3次，每次5min;每张切片加一滴过氧化酶阻断剂(试剂A)，室温下孵育10min;再用PBS洗3次后，滴加非免疫性动物血清(试剂B)，37℃孵育5min;弃去非免疫性动物血清;滴加一抗，4℃过夜;PBS洗3次后再滴加二抗(试剂C)，37℃孵育10min;PBS洗3次后滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶溶液(试剂D)，37℃孵育10min;PBS洗3次后，用新鲜配制的DAB显色液显色，显微镜下观察2～5min;自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片;利用图像分析系统进行灰度扫描分析。

1.4 统计学分析 用SPSS13.0统计软件进行数据处理，采用方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

从图1-图2可看出，正常组MCP-1、NF-κB表达于胞浆质中，可见肝细胞质中散在分布少量浅黄色颗粒。模型组MCP-1、NF-κB的表达增强，细胞质中棕黄色颗粒增多，肝细胞核出现棕黄色阳性着色;干预组肝细胞质中散的分布浅黄色颗粒少。灰度扫描结果显示，金樱子干预组MCP-1、NF-κB蛋白的表达低于糖尿病模型组(P＜0.05);金樱子对照组MCP-1、NF-κB蛋白的表达与正常对照组比较无差异(P＞0.05)。

图1 MCP-1蛋白的表达结果

图2 NF-κB蛋白的表达结果

3 讨论

氧化应激(OxidativeStress，OS)，就是由于某种或多种原因而破坏了机体内强氧化剂和抗氧化剂的平衡导致的潜在伤害。现在，氧化应激被认为是造成糖尿病及其并发症、肺纤维化、癫痫、高血压、动脉粥样硬化、癌症、肾病变和帕金森症等疾病的重要原因。目前研究认为，糖尿病及其并发症的发生、发展和病情程度与自由基引发和介导的机体氧化损伤和机体抗氧化防御系统清除自由基能力的平衡失调密切相关［4］。

研究表明肝脏中的IKK/IκB/NF-κB信号通路，在糖尿病发生和肝脏的炎症过程中起到了重要作用，机体受到如:活性氧自由基(ROS)等刺激，IKK-β被活化，被活化的IKK-β使IκB-α发生磷酸化，IκB-α的磷酸化使得其被蛋白酶小体快速降解泛素化降解，从而使得原本与 IκB-α结合的NF-κB游离出来，进入细胞核，启动炎症因子如:MCP-1等基因的转录。进而引发了胰岛素抵抗和肝脏的炎症［5，6］。胰岛素抵抗发生时，肝细胞内出现活性氧族应激反应，由于三酰甘油在肝细胞内蓄积，大量的游离脂肪酸在线粒体内氧化，产生了过多的超氧阴离子和ROS，使抗氧化物质耗竭。因此，活性氧和许多自由基不能完全代谢。而过多的ROS又可损伤线粒体，导致更多的ROS生成。ROS还可以激活肝脏中IKK/IκB/NF-κB信号通路，导致肝脏过多的表达和分泌炎症细胞因子如:TNF-α、IL-1、IL-6 和 MCP-1 等［6］。

本研究采用高糖高脂和腹腔注射STZ相互结合的方法构建二型糖尿病模型，结果发现金樱子能抑制糖尿病大鼠肝脏 MCP-1、NF-κB蛋白的表达，明显缓解糖尿病大鼠的氧化应激，显著增强其机体抗氧化能力，从而为防治糖尿病提供了新依据。

［1］周钰娟，廖前进，张秋菊，等.金樱子对大鼠糖尿病肾脏的实验研究.南华大学学报(医学版)，2007，35(3):332-335.

［2］洪丽莉，许冠荪，申国明，等.SD大鼠2型糖尿病模型的建立.中国比较医学杂志，2005，15(6):379-381.

［3］Luo J，Quan J，Tsai J，et al. Nongenetic mouse models of Non-InsulinDependent Diabetes Mellitus. Metabolism，1998， 47 ( 6 ) :663-668.

［4］Maritim A C，Sanders R A，Watkins J B Ⅲ. Diabetes，oxidativestress，and antioxidant: a review. J Biochem Mol Toxical，2003，17( 1) : 24-38.

［5］Arkan MC，Hevener AL，Greten FR，Maeda S. IKK-beta links inflammationto obesity-induced insulin resistance. Nat Med，2005，11( 2) : 191-198.

［6］Boden G，She P，Mozzoli M，et al. Free fatty acids produce insulinresistance and activate the proinflammatory nuclear factor-kappaBpathway in rat liver. Diabetes，2005，54( 12) : 3458-3465.