不同中医内治法对实验性家兔视网膜血管病变的干预研究

张志芳 李庆生

视网膜血管炎（retinal vasculitis，RV）是一大类累及视网膜血管的眼内炎症性疾病〔1〕，仅侵犯动脉或静脉较少见，多数是两者均受累。它主要发生于年轻人，且视力受损比较严重〔2〕。目前对视网膜血管炎的治疗主要是应用糖皮质激素和各种新型免疫抑制剂，但对于这些疗法的使用仍存在较大争议。

根据我们前期实验〔3〕，用庆大霉素 500μg 对家兔进行玻璃体腔注射后视网膜结构损伤相对较轻，视网膜及血管能产生持续平稳的炎性反应，其临床特点及病理改变与视网膜血管炎有很多相似之处，不失为一个良好的造模方法。前期实验中使用《千金要方》犀角地黄汤、地塞米松和生理盐水对庆大霉素致家兔视网膜损伤模型进行疗效观察〔4〕，结果表明，犀角地黄汤中剂量对庆大霉素致视网膜及血管的损伤有明显的治疗作用。

我们在中医眼科理论指导下，选用方剂犀角地黄汤、桃红四物汤、黄连解毒汤及知柏地黄汤对庆大霉素致青紫蓝兔视网膜损伤模型进行观察，从临床表现、病理组织及超微结构等方面进行比较，对中药治疗视网膜药源性损伤及继发的炎症反应进行疗效评价和作用机理的探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：青紫蓝兔64只，雌雄各半，体重2~2.5kg，普通级环境下分笼饲养，22~25℃，循环光照（14h/10h，光照/黑暗）。购自北京生物制品有限公司。

1.1.2 主要药物和试剂：中药均购自北京燕北饮片厂（批号041016）经中药剂师鉴定并水煎制成浓缩液：大剂量组相当于临床剂量4倍；中剂量组相当于临床剂量2倍，参考《药理实验方法学》与人折算。具体方药如下：犀角地黄汤《千金要方》：水牛角30g、生地24g、赤芍12g、丹皮9g。桃红四物汤《医宗金鉴》：桃仁 9g、红花 6g、当归 9g、川芎 6g、赤芍 9g、生地12g。黄连解毒汤《外台秘要》：黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g。知柏地黄汤 《医宗金鉴》：熟地24g、山药 12g、丹皮 9g、茯苓 9g、泽泻 9g、黄柏 9g、知母9g、山萸肉12g。其它药物及试剂：庆大霉素（天津金耀氨基酸有限公司，批号0406092），水合氯醛（北京市旭东化工厂，批号040512），荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司，批号H44023401）ICAM-1抗体（Santa Cruz公司），von Willebrand因子抗体（Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：64只健康青紫蓝兔适应性喂养3天后，随机分为8组，每组8只，分别为空白对照组（I组）、阳性对照组犀角地黄汤中剂量组（II组）及实验组桃红四物汤大剂量组（III组）、中剂量组（IV组）；黄连解毒汤大剂量组（V组）、中剂量组（VI组）；知柏地黄汤大剂量组（VII组）、中剂量组（VIII组）。

1.2.2 造模方法：将青紫蓝兔用10%水合氯醛腹腔注射全身麻醉后，眼局部滴用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，先用1ml注射器针头在下方角膜缘平行穿刺放出0.1ml房水，而后用装有29号TB针头的1ml注射器自上方角膜缘后3~5mm刺入玻璃体，直接检眼镜观察下使针尖达玻璃体中央，并使针尖背向视网膜，缓慢注入庆大霉素500μg（药物使用生理盐水稀释，尽量避免稀释偏差，容量均为0.1ml），而后缓慢拔针，用棉签轻按针孔数秒后观察晶体无划伤、玻璃体内无出血者继续进行实验观察。

1.2.3 给药方法：造模24h后开始给药，空白对照组用生理盐水给家兔灌胃，2次/天，5ml/次；中药各组分别用不同浓度中药灌胃，2次/天，5ml/次。

1.2.4 眼科检查：从给药第1天起用裂隙灯及检眼镜密切观察各兔眼部体征。于造模后第7天、14天用眼底荧光血管造影仪进行各组兔的眼底彩照和荧光素眼底血管造影（将家兔全麻及局麻后，用美多丽滴眼液充分散瞳，由助手将兔头部固定于仪器下颌托上，通过调整兔头部和仪器的相对位置采集眼底信息）。观察各组兔眼前、后节的病理变化，记录各个阳性体征，参照张惠蓉等报道的方法〔5〕，将眼底彩照组合后用计算机图象分析处理系统测算视网膜出血面积和视盘面积比值。

1.2.5 病理检查：分别于给药后第7天、14天全麻后摘除每组4只家兔双眼，每组随机取6只眼球完整置于10%甲醛溶液中固定，余2只眼球快速从角膜缘切开，轻取出晶状体及玻璃体后立即置于4℃2.5%戊二醛溶液中固定，行电镜观察。HE染色下行炎性细胞记数：定位每一张眼球壁全层切片连续3个切面中视网膜血管区，用细胞分类记数器于20倍光镜下记数每个切面中全部血管及周围一个直径区域的炎性细胞数量及分类，计算其平均值。免疫组织化学结果分析：每一张组织切片分别选取3个连续视野对血管区视网膜进行图象采集，用计算机图象分析处理软件测算灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0软件系统进行统计学处理，计量资料采用t检验。

2 结果

2.1 视网膜出血面积和视盘面积比值（表1）

表1 视网膜出血面积和视盘面积比值统计表（N=6）（±SD）

表1 视网膜出血面积和视盘面积比值统计表（N=6）（±SD）

注：①P＜0.01；②P＜0.05。

组 别 7天 1 4天空白对照组 Ⅰ 3.1 9 0±1.2 2 6 1.7 2 7±0.5 1 8阳性对照组 Ⅱ 1.2 8 0±0.2 5 0①② 1.1 7 2±0.5 2 7②实验组 Ⅲ 2.0 9 4±0.6 9 8① 0.6 6 8±0.5 3 4①②Ⅳ 1.9 7 1± 0.6 8 8① 0.3 4 8± 0.4 7 7①Ⅴ 1.9 7 4± 0.5 8 5① 0.9 2 8± 0.4 7 8①②Ⅵ 0.5 4 6± 0.3 5 6① 0.8 3 9± 0.4 7 2①②Ⅶ 1.4 2 6± 0.2 7 8①② 1.2 2 7± 0.4 2 7②Ⅷ 1.4 0 5± 0.2 5 9①② 1.0 9 3± 0.4 5 1②

空白对照组第14天出血比第7天减少，出血逐渐吸收，表明第7天是视网膜出血高峰。各中药治疗组都有明显抑制视网膜出血的作用。第7天时阳性对照组、实验组与空白对照组相比：t值依次为5.365,5.120,5.138,5.134,5.402,5.321,5.389,P＜0.01。黄连解毒汤中剂量组（VI组）与其它中药治疗组相比出血量最少：Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ组t值依次为1.568、1.894、1.649,P＜0.05；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组 t值依次为 2.985、2.502、2.451，P＜0.01。 第 14 天时阳性对照组、实验组与空白对照组相比：Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ组t值依次为1.756、1.542、1.875，P＜0.05； Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、VI组 t值依次为2.708、2.886、 2.598、2.643，P＜0.01。 桃红四物汤中剂量组 （IV组）与其它中药治疗组相比出血量最少：t值依次为 1.785、1.498、1.685、1.603、1.804,1.756，P＜0.05。

2.2 视网膜血管及周围炎性细胞记数及分类（表2）

表2 视网膜血管及周围炎性细胞数量统计表（N=6）（±SD）

表2 视网膜血管及周围炎性细胞数量统计表（N=6）（±SD）

注：①P＜0.01；②P＜0.05；③P＞0.05。

组 别 7天 14天空白对照组 Ⅰ 0.811±0.160 0.741±0.050阳性对照组 Ⅱ 0.555±0.110② 0.525±0.129②实验组 Ⅲ 0.382±0.210① 0.351±0.176①②Ⅳ 0.352± 0.189① 0.293± 0.125①Ⅴ 0.496± 0.344① 0.467± 0.100①Ⅵ 0.410± 0.216① 0.397± 0.051①Ⅶ 0.760± 0.116③ 0.631± 0.209③Ⅷ 0.713± 0.145③ 0.581± 0.195③

除知柏地黄汤大剂量组、中剂量组外，其它各中药治疗组均有明显减少视网膜炎性细胞数量的作用。第7天时阳性对照组、实验组与空白对照组相比:Ⅱ组 t值为 2.243，P＜0.05；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、VI组 t值依次为 2.780、2.868、2.645、2.675，P＜0.01；Ⅶ、Ⅷ组 t值依次为 1.309、1.324，P＞0.05。 第 14 天时阳性对照组、实验组与空白对照组相比:Ⅱ组t值为2.438，P＜0.05；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、VI组 t值依次为 3.143、3.256、2.898、3.098，P＜0.01； Ⅶ、 Ⅷ组 t值依次为 1.012、1.240，P＞0.05。与犀角地黄汤组（II组）相比:Ⅲ组 t值为 2.904，P＜0.05;Ⅳ组 t值为 3.253，P＜0.01。

2.3 免疫组织化学结果分析

2.3.1 视网膜ICAM-1表达结果（表3）：第7天时阳性对照组、实验组与空白对照组相比：Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、VI、 Ⅶ、 Ⅷ组 t值依次为 3.381、3.430、3.134、3.389、3.289、3.296，P＜0.01；Ⅲ组 t值为 1.410,P＞0.05。 桃红四物汤中剂量组（IV组）比大剂量组（III组）ICAM-1的表达明显降低:t值为3.426,P＜0.01。黄连解毒汤中剂量组（VI组）比黄连解毒汤大剂量组（V组）ICAM-1的表达明显降低:t值为2.278,P＜0.05。第14天时与空白对照组相比:Ⅳ组t值为3.351,P＜0.01；VI组t值为2.787,P＜0.05。与犀角地黄汤中剂量组（II组）相比:Ⅲ、Ⅴ组 t值依次为 2.386、2.466,P＜0.05；Ⅳ、VI组 t值依次为 3.318、3.105，P＜0.01。桃红四物汤中剂量组（IV组）比大剂量组（III组）I CAM-1 的表达明显降低:t值为 3，465，P＜0.01。

表3 视网膜血管区 ICAM-1的 OD 值（N=6）（±SD）

表3 视网膜血管区 ICAM-1的 OD 值（N=6）（±SD）

注：①P＜0.01；②P＜0.05；③P＞0.05。

组 别 7天 14天空白对照组 Ⅰ 0.242±0.001 0.236±0.001阳性对照组 Ⅱ 0.238±0.001① 0.237±0.001实验组 Ⅲ 0.241±0.003③ 0.236±0.002②Ⅳ 0.237± 0.001① 0.233± 0.001①Ⅴ 0.240± 0.002① 0.235± 0.001②Ⅵ 0.238± 0.001①② 0.234± 0.003②Ⅶ 0.239± 0.002① 0.237± 0.001Ⅷ 0.238± 0.002① 0.236± 0.002

2.3.2 视网膜von Willebrand因子表达结果（表4）：第7天时阳性对照组、实验组与空白对照组相比:t值依次为1.435,1.763,1.743,1.598,1.746,1.759,1.756,P>0.05。与犀角地黄汤中剂量组（II组）相比:Ⅲ、Ⅶ组t值依次为2.246，2.223，P<0.05。 第 14天时与犀角地黄汤中剂量组（II组）相比:Ⅴ、Ⅶ组t值依次为2.098,1.989,P<0.05。

表4 视网膜血管区von Willebrand因子的OD值（N=6）（±SD）

表4 视网膜血管区von Willebrand因子的OD值（N=6）（±SD）

注：①P＜0.05；②P＞0.05。

组 别 7天 14天空白对照组 Ⅰ 0.244±0.002 0.237±0.001阳性对照组 Ⅱ 0.266±0.066② 0.241±0.003实验组 Ⅲ 0.237±0.002①② 0.240±0.006Ⅳ 0.240± 0.002② 0.239± 0.001Ⅴ 0.243± 0.004② 0.237± 0.001①Ⅵ 0.240± 0.002② 0.237± 0.001Ⅶ 0.238± 0.002①② 0.237± 0.001①Ⅷ 0.238± 0.003② 0.241± 0.001

2.4 视网膜血管消化铺片

空白对照组视网膜大量出血，血管迂曲扩张，呈节段状阻塞，血管及其周围可见大量炎性细胞浸润，大部分出现内皮细胞和周细胞的凋亡小体，管壁细胞稀疏，可见新生血管生成；各中药治疗组视网膜可见不同程度的出血，血管迂曲，较空白对照组为轻，大量红细胞填塞血管腔，炎性细胞局部浸润，偶见内皮细胞和周细胞的凋亡小体，可见新生血管生成；第14天与第7天相比，各组视网膜血管消化铺片表现均有不同程度的减轻。

2.5 电镜观察

空白对照组第7天视网膜血管栓塞，内皮细胞线粒体嵴断裂，核仁边聚，RPE细胞结构破坏严重，胞浆大量线粒体空泡变，类脂体增多，细胞核空泡变，神经节细胞、内颗粒层细胞、外颗粒层外侧线粒体均变性。第14天视神经髓鞘变性，局部液化、膨出，鞘轴间隙增宽，神经节细胞线粒体肿胀、核溶解。其它各中药治疗组第7天RPE细胞核空化，顶端微绒毛减少，线粒体空泡变，有个别巨噬细胞突破RPE膜。视网膜血管内皮细胞、周细胞线粒体肿胀，类脂体增多，神经纤维局灶性坏死，空泡形成，神经节细胞胞质空化、水肿。RPE细胞核内可见初、次级溶酶体。第14天RPE细胞核空泡变，感光细胞外节脱落，RPE、内皮细胞、血管平滑肌细胞及神经节细胞线粒体均肿胀。

3 讨论

视网膜血管炎似属祖国医学 “云雾移睛”、“暴盲”、“血衄”等范畴，多从“血证”讨论〔6〕。 历代医家认为，出血的原因主要有：气不摄血、血热妄行及瘀血内停。临床所见视网膜血管炎所致的视网膜和玻璃体出血，多数不能及时吸收，瘀积于眼底是为瘀血，瘀久化热成为瘀热。故瘀与热两者互为因果，以致于长期反复出血。目前在治疗本病时，出血初发或复发，比较新鲜时，病属热重于瘀，则凉血止血，佐以祛瘀；眼底出血较陈旧，或玻璃体出血久不吸收，病属瘀重于热，则活血化瘀，佐以凉血止血；出血基本吸收，视网膜血管炎症比较稳定，病属瘀热伤阴，则滋阴凉血，佐以散瘀之品。

本研究结果表明，桃红四物汤中剂量能明显改善庆大霉素致家兔视网膜出血及炎症反应，减少视网膜血管及其周围炎性细胞数量，明显降低视网膜血管区ICAM-1的表达，其对视网膜von Willebrand因子表达的下调作用并不明显，推测它可能是通过降低视网膜ICAM-1的表达从而减少炎性细胞黏附而减轻炎症反应。桃红四物汤出自清代吴谦所著的《医宗金鉴》，方由四物汤加桃仁、红花组成，具养血活血之功效，主治妇女月经先期属血瘀者。根据现代药理研究，桃红四物汤治疗很多眼科疾病均有良好的疗效〔7〕。其眼科药理如下：当归能显著提高人体免疫功能，促进吞噬作用，有很强的干扰素诱生作用，有抗炎镇痛及抗损伤作用；白芍有明显镇痛、解痉、抗炎、抗溃疡作用，能促进巨噬细胞的吞噬功能，有较强的广谱抗菌作用；川芎所含川芎嗪能增强单核巨噬细胞的吞噬功能，提高淋巴细胞转化率，促进抗体的形成，可以抑制血小板形成，可使已聚集的血小板迅速解聚，达到化瘀效果；熟地、生地均有止血和抑制血栓形成的作用，故既可生血、养血，又可化瘀通经；红花可抑制血小板凝聚和增强纤维蛋白溶解，有抑菌抗炎和解痉作用；桃仁有抗炎、抗过敏作用。综观全方，其活血散瘀力较强，有推陈出新之功。由此推断，桃红四物汤可通过多种作用机制抗凝活血，减轻组织血管的炎症反应，改善循环，因而对于临床视网膜血管炎症性疾病有着广泛有效的应用前景。

黄连解毒汤是唐代医家王焘引录前人崔氏的名方,载于其所编著的《外台秘要》中,是清热解毒的代表方,具清热、泻火、解毒之功效,主治实热火毒、三焦热盛证。实验结果显示,其中剂量在早期能明显减少视网膜出血，我们分析这与庆大霉素致家兔视网膜损伤为急性毒性反应，主要表现为血管栓塞出血，而中药药理学的现代研究表明,将其提取物灌胃,对家兔体内血栓形成有显著的抑制作用,并能抑制ADP诱导的兔血小板聚集〔8〕；在体外，黄连解毒汤能抑制肾上腺素、胶原、血清血栓形成促进因子Ⅱ、花生四烯酸诱导的血小板聚集，同时还能抑制肾上腺素、ADP、胶原等诱导的血小板释放功能〔9〕有很大关系。知柏地黄汤同样出自《医宗金鉴》，具有滋阴降火之功效,主治阴虚火旺、骨蒸潮热证。它对庆大霉素致视网膜血管损伤的保护作用可能在14天之后，即病变的更晚期阶段，才能表现出来，因为视网膜血管炎症后期往往瘀热伤阴，此时治宜滋阴凉血，佐以散瘀之品。

上述分析提示，在临床上对于视网膜血管疾病的中医药治疗，我们可以根据疾病的不同分期、不同分型，选择使用相应的治则方药，从而获得良好的疗效。早期热毒壅盛，宜用黄连解毒汤以清热解毒；中期血脉瘀阻，用桃红四物汤以活血化瘀；晚期阴虚内热，可以用知柏地黄汤以养阴清热，同时结合患者病情，配合使用其它药物治疗。

1 George RK，Walton C，Whitcup SM，et al.Primary retinal vasculitis[J].Ophthalmology，1996，103（3）：384-389.

2 赵桂玲，易长贤.视网膜血管炎[J].眼科学报，2002，18（4）：199-202.

3 江 伟，王志强，李庆生，等.犀角地黄汤对庆大霉素致视网膜血管损伤的疗效观察[J].中国中医眼科杂志，2008，18（5）:253-256.

4 江 伟，王志强，李庆生，等.庆大霉素玻璃体腔注射对兔视网膜血管的影响[J].国际眼科杂志，2006，6（3）:599-602.

5 张惠蓉，夏英杰，田 力.微机图像定量分析视网膜静脉阻塞的新生血管与无灌注区的关系 [J].中华眼科杂志，1992，28（6）:335-337.

6 唐由之，肖国士.中医眼科全书 [M].北京：人民卫生出版社，1996.829-832.

7 陈凌燕，陈 峰.桃红四物汤在眼科临床治验[J].中国乡村医药杂志，2003，10（2）:36-37.

8 曹于平，阜 聪，孙继红.黄连解毒汤提取物的药理作用研究[J].中国药科大学学报，1996，27（10）:605-608.

9 杨丽波，金 航.黄连解毒汤对血小板功能的影响[J].国外医学·中医中药分册，1994，16（1）:29-30.