干扰素生物活性两种测定方法的比较研究

2010-05-29赵鸿

中国医药导报 2010年10期

赵鸿

（北京双鹭药业股份有限公司，北京 100041）

干扰素（interferon，IFN）是第一个被发现的细胞因子，也是第一个应用于临床的基因工程产品。根据其来源、理化性质、氨基酸序列和生物学活性的不同，可分为α、β、γ三种类型。IFN的作用具有种属特异性，其主要功能有抗病毒、抗肿瘤、增强NK、Tc细胞的活性及进行免疫调节等多种生物学活性，是一类重要的细胞因子。通常干扰素生物活性测定方法是采用《中国药典》三部附录ⅩC细胞病变抑制法（结晶紫染色法，方法一）。由于日常实验中发现生物活性测定曲线不理想，重复性较差，故对其操作进行一些改动，同时考虑到该实验中间操作较多，容易引入操作误差，故探讨一种中间操作少的方法，以减少实验误差，提高实验结果的准确性。MTT比色法（方法二）广泛应用于细胞生物活性检测，故笔者旨在通过本实验证实改进的结晶紫染色法与MTT比色法哪一种方法更适合用于干扰素生物活性的测定，得到更为准确的实验结果，为干扰素的临床应用提供有力的保证。

1 材料与方法

1.1 原理

1.1.1 方法一原理根据干扰素能刺激某些指示细胞，如人羊膜上皮细胞（WISH细胞）、人喉癌细胞（Hep2细胞）、人胚肌皮细胞和肺单层细胞（2BS细胞）等，产生抗病毒蛋白，使细胞免受牛水泡性口炎病毒（VSV）的攻击。根据待测样品干扰素不同稀释度的保护能力，计算出干扰素的生物活性单位。

1.1.2 方法二原理 MTT比色法的基本原理是活细胞线粒体中富含琥珀酸脱氢酶，氧化型MTT进入细胞后可被该酶还原生成蓝色formazan颗粒，沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关。

1.2 实验试剂、材料与实验器具

1.2.1 DMEM培养液取DMEM培养基粉末1袋（Gibco公司，规格为1 L，批号31600-034），加水溶解并稀释至1 000 ml，加青霉素1.0×105U和链霉素10.×105U，再加碳酸氢钠2.0 g、L-谷氨酰胺 0.292 3 g（Sigma公司，批号 G3126）、HEPES 2.838 g（Amersco公司）溶解后，混匀，过滤除菌，4℃保存。

1.2.2 基础培养液（10%）取新生牛血清10 ml（四季青生物公司，批号061202），加DMEM培养液至100 ml，4℃保存。

1.2.3 测定培养液（7%）取新生牛血清7 ml，加DMEM培养液至 100 ml，4℃保存。

1.2.4 攻毒培养液（2%）取新生牛血清2 ml，加DMEM培养液至 100 ml，4℃保存。。

1.2.5 消化液 0.5%胰蛋白酶消化液∶0.02%EDTA=1∶1（0.5%胰蛋白酶及0.02%EDTA均用PBS溶液配制）。

1.2.6 染色液结晶紫染色液（0.1 g+20 ml无水乙醇溶解后加水至 100 ml）。

1.2.7 脱色液 50%无水乙醇、50%蒸馏水及0.1%乙酸。

1.2.8 细胞 WISH细胞。

1.2.9 VSV-70℃冻存。

1.2.10 裂解液取十二烷基硫酸钠（SDS，分析纯）15 g，用适量蒸馏水和50 ml DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，加蒸馏水至100 ml，用盐酸调节pH至4.7。

1.2.11 MTT溶液取0.5 g MTT，加 PBS溶解成 100 ml，配制成0.5%MTT溶液，经0.22 μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

1.2.12 PBS溶液取8 g氯化钠、0.2 g氯化钾、1.44 g磷酸氢二钠、0.24 g磷酸二氢钾加蒸馏水配成1 000 ml溶液，经121℃15 min高压灭菌。

1.2.13 干扰素α活性测定国家标准品批号97/04，-20℃贮存，7 500 IU/支。

1.2.14 器材 96孔细胞培养板若干个，百级工作台，二氧化碳培养箱（三洋公司），酶标仪（Molecular Devices公司），生物倒置显微镜（COIC，重庆光学仪器厂），单道微量移液器，8道微量移液器，无菌1.5 ml塑料离心管和200 μl、1 ml tip头若干。

1.3 测定法（以下操作均为无菌操作）

1.3.1 方法一[1]①使WISH细胞在培养基中贴壁生长，按1∶2～1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中培养。轻摇WISH细胞，弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗2次后加消化液（0.5%胰蛋白酶消化液∶0.02%EDTA=1∶1，即 1.5 ml∶1.5 ml）消化，镜下观察消化程度，见镜下大部分细胞离散后，吸弃消化液，立即加5 ml 10%DMEM培养液，终止消化反应，用10 ml移液管用力吹打将细胞吹散，镜下观察大部分细胞呈单个细胞，用10%DMEM培养液配成3.0×105个/ml的细胞悬液，接种于 96孔培养板中，每孔 100 μl，37℃，5%CO2条件下培养4～6 h。②标准品溶液的配制：取1支干扰素活性测定国家标准品，按使用说明书复溶后，用7%DMEM培养液稀释至1 000 IU/ml（IFN国家标准品直接加7%DMEM培养液220 μl稀释）。在96孔培养板中，以4倍稀释度做梯度稀释（50 μl+150 μl），共8个稀释度，每个稀释度做2个复孔。供试品溶液的配制：将供试品按标示量复溶后，用7%DMEM培养液稀释成约1 000 IU/ml。在96孔培养板中，以4倍稀释度做梯度稀释，共8个稀释度，每个梯度做2个复孔。③将②项配制的标准品溶液和供试品溶液加入接种WISH细胞的培养板中，每孔 100 μl，于 37℃、5%CO2条件下培养 18～24 h。 ④制备病毒液与攻毒：取-70℃冻存的VSV用2%DMEM攻毒培养液稀释至100TCID50。吸弃细胞培养板的上清，将稀释好的病毒液加入培养板中，每孔 100 μl，37℃、5%CO2培养 24 h。⑤镜检标准溶液的50%病变点在1 IU/ml，即为F行。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入50 μl结晶紫染色液，室温放置30 min后，用水盆盛上纯化水，换水漂洗培养板3次，并在吸水纸上轻叩几下，然后每孔加入100 μl脱色液，室温放置5～10 min。用微量振荡器振荡混匀1～2 min，然后于波长540 nm处测定。根据样品稀释倍数计算实验测定结果。

1.3.2 方法二[1-3]此方法中①～④与方法一中相同。⑤每孔加入 0.5%MTT 溶液 20 μl，于 37℃、5%CO2条件下培养 5 h，然后每孔加入100 μl裂解液，于37℃、5%CO2条件下培养过夜，用微量振荡器振荡混匀1～2 min，然后于波长540 nm处测定。根据样品稀释倍数计算实验测定结果。