rhBNP对急性心肌梗死再灌注后急性期细胞因子、心肌凋亡的实验研究

崔丽杰，李占全，袁 龙，张薇薇，赵鸿梅，彭妍钰

（辽宁省人民医院心内科，辽宁沈阳 110016）

脑利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）是由 32个氨基酸残基组成的17环状多肽，BNP通过与其受体结合，从而介导一系列生理学效应，上述生理学作用可以明显改善心功能。实验证实，通过敲除BNP基因，心房肽（ANP）或BNP或其相应受体受到破坏，可以导致血压上升和（或）心肌纤维化的发生；BNP通过改善肾脏功能或通过神经激素的作用，降低心室内压力和缓解失代偿性心力衰竭患者的呼吸困难。重组人脑利钠钛（rhBNP），国外商品名为奈西利肽，已经被美国FDA批准为急性失代偿性心力衰竭治疗的一线用药，它的另一个治疗应用前景为心肌梗死后的早期治疗。有个案报道急性心肌梗死（AMI）后应用重组人ANP对左室重构有利[1]，但对于心肌梗死后阶段早期应用奈西利肽少有报道。本研究旨在观察AMI再灌注后早期应用rhBNP对急性期细胞因子及心肌凋亡的影响，为寻求新的治疗AMI的方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雌性杂种犬15只，体重12～20 kg，购自中国药科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 AMI再灌注模型的构建及实验分组 术前禁食8 h，3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，将犬仰卧固定于操作台上，右股动脉穿刺置入6F动脉鞘管，穿刺对侧股静脉置入6F鞘管备补液及抢救用药。经股动脉弹丸式注入肝素钠2 500 U，每隔1 h左右追加肝素钠1 250 U。冠脉指引导管行冠脉造影，后置入PTCA导丝，在导丝指引下置入（2.0～2.5）mm×（9～15）mm的人PTCA球囊至左前降支（LAD）或左旋支（LCX）中段以下，球囊经缺血预适应3～4次，打开球囊，造影显示球囊远端血流中断。90 min后撤除球囊，重新造影示封堵冠脉血流再通。保留左冠脉guilding指引导管，备冠脉取血及冠脉内用药。术中1只犬麻醉过量，2只犬出现室颤死亡；其余12只犬模型制作成功。实验犬随机分为rhBNP组和对照组。rhBNP组以冻干rhBNP（商品名新活素，0.5 mg/支；西藏诺迪康药业股份有限公司，国药准字S20050033）以0.9 μg/kg冠脉注射＞3min；后以 0.06 μg/（kg·min）静脉滴注 60 min。 对照组以等体积生理盐水作同期对照。

1.2.2 细胞因子检测 术前及球囊封堵后90、210 min股静脉采血5 ml，球囊封堵后90 min于左冠脉采血5 ml，置于加有1.5 mg/ml乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管中，室温下1 000 g离心15 min后取血浆1.5 ml置于指形试管中，将所有标本置于-80℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测量血浆BNP、ET-1水平。严格按说明书操作。

1.2.3 梗死边缘心肌细胞凋亡检测 PTCA术后210 min应用10%氯化钾注射液15～20 ml静推处死动物，于心尖部沿短轴方向剖开心脏，沿心脏短轴将心脏切为横断组织块（厚度约2 mm），在梗死边缘心肌取材，置于10%中性甲醛固定液中固定24 h，组织包埋后石蜡切片，原位细胞死亡检测试剂盒检测凋亡心肌细胞含量（AI）。严格按说明书操作。

1.3 统计学处理

计量数据以均数±标准差（x±s）表示，计数资料以频数表示，采用SPSS 13.0软件分析，计量资料统计采用多因数方差分析、配对t检验及成组t检验，计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料

两组犬在体重、梗死相关动脉及冠脉优势情况方面差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 两组血浆BNP水平比较

见表1。

表1 两组血浆BNP水平比较（x±s，pg/ml）

2.3 两组血浆ET-1水平比较

见表2。

表2 两组血浆ET-1水平比较（x±s，pg/ml）

2.4 两组凋亡心肌比较

rhBNP组凋亡阳性细胞指数为（17.5±2.9）%，对照组为（24.5±3.6）%，两组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

心肌在较长时间缺血造成一定损伤后，恢复供血不但不减轻或逆转损伤，反而加重损伤，这种现象称为缺血-再灌注损伤。在缺血-再灌注过程中，内皮细胞受到刺激合成并释放ET-1，后者有很强的缩血管作用，导致血管增殖，加重心室和血管的纤维化，同时也是其他神经内分泌物质的强化因子，并参与调节BNP合成和释放[2-3]。因此，本研究以AMI再灌注血清学水平观察血浆BNP、ET-1水平的变化，探讨应用rhBNP对心脏的保护作用。本研究显示，对照组犬在球囊封堵后90 min血浆ET-1水平有所升高，再灌注2 h后的血浆ET-1水平明显升高，提示再灌注后ET-1合成和释放增多，这与Tonnessen等[4]的报道一致，犬在球囊封堵90 min后血浆BNP水平有所升高，但差异无统计学意义，提示BNP未能与ET-1相平衡，这符合既往结论[5]；210 min后血浆BNP水平则显著升高，提示可能出现心功能不全，这也符合心衰犬的BNP可信区间[6]。冠脉血浆BNP和ET-1水平高于术前外周血相应因子水平，提示冠脉内细胞因子变化更明显，缺血早期心肌内启动了自我调节机制，是一个对急性组织损伤的急性期反应；且也为缺血-再灌注后即刻冠脉应用rhBNP提供时间依据。rhBNP组术后210 min外周血BNP及ET-1水平差异无统计学意义，提示外源性应用rhBNP可能对内皮细胞有一定的保护作用，减少缺血-再灌注损伤。

心肌缺血-再灌注可致冠状血管及心肌受损，ANP及BNP孵化的人类中性粒细胞能调节细胞功能，并减弱其介导的内皮细胞毒性作用。在冠脉再灌注治疗中应用低剂量利钠肽，能够限制短暂性冠状动脉阻塞所致的心肌细胞死亡[7]。Fiscus等[8]采用原位末端标记技术发现缺血-再灌注大鼠心肌细胞中有典型的凋亡形态改变，认为细胞凋亡是缺血-再灌注损伤的特征之一。本实验发现，rhBNP组凋亡心肌数量显著低于对照组，提示应用rhBNP可减少凋亡，对心脏有保护作用，这也与有关报道相符。

综上所述，AMI再灌注早期应用rhBNP可减少梗死后再灌注损伤，但由于本实验的样本有限，在今后的研究中需进一步扩充样本量，为临床AMI患者观察再灌注损伤提供参考。

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