超临界CO2萃取法和醇回流法提取灵芝中三萜类成分的比较

贾晓斌， 宋师花， 陈 彦， 王丽静， 封 亮

（1.江苏大学药学院，江苏镇江 212013;2.江苏省中医药研究院中药新型给药系统重点实验室，江苏 南京 210028;3.国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏南京 210028）

灵芝是多孔菌科灵芝属真菌，子实体为其药用部位之一。其中灵芝三萜类成分是灵芝的主要有效成分，文献报道［1-2］，具有抗肿瘤、抗氧化、保肝、镇痛等药理作用，其中灵芝酸B是灵芝中一种重要的三萜类成分［3］。

醇回流提取法是工业上从灵芝子实体中提取三萜类成分的常用方法，但其有提取时间长、提取次数多，浪费有机溶剂并有残留等诸多缺点。超临界CO2流体萃取具有萃取时间短，萃取次数少，绿色无污染等优点，具有很好的发展前景。关于灵芝子实体中三萜类成分的提取工艺，既有醇回流提取法最佳工艺的报道［4-5］，也有超临界CO2萃取法最佳条件的报道［6］，但却未见这二种提取方法比较的研究，因此本文在文献报道的基础上，以醇回流提取的最佳条件和超临界CO2流体萃取的最佳条件分别提取灵芝中三萜类成分，然后通过比较HPLC图谱、RP-HPLC法测定的灵芝酸B含量、可见分光光度法测定的灵芝三萜含量、固形物含量等4个指标，综合、全面的评价这两种提取方法，以期为工业提取灵芝子实体中三萜类成分提供更多、更新、更科学的依据。

1 仪器

HA221-40（50）-25型超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司）;Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent科技公司），包括:在线脱气机，四元梯度泵，自动进样器，恒温柱温箱，DAD检测器，Agilent 1200化学工作站;METLER TOLEDO分析天平（精密度万分之一和百万分之一，METLER TOLEDO分析仪器有限公司）;UV-2802型紫外可见分光光度计（上海尤尼克仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 样品液的制备

2.1.1 SFE（CO2）提取液 根据课题组前文［6］研究结果，选择最佳条件:将灵芝子实体切片再进一步粉碎过12目筛，取灵芝子实体颗粒100 g装入1 L的萃取釜中，设置萃取釜压力为25 MPa，温度为45℃，夹带剂为95%乙醇，用量为300 mL，萃取时间为1.5 h;设置分离釜I压力为7 MPa，温度为50℃;设置分离釜Ⅱ压力为4 MPa，温度为36℃，CO2流量为30 L/h。萃取结束后，从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液，加95%乙醇定容至500 mL，即得。

2.1.2 醇回流提取液［5］将灵芝子实体粉碎过12目筛，取100 g，加10倍量95%乙醇，加热回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，过滤，回收溶剂，用乙醇定容至500 mL，即得。

2.2 供试液的制备［7］

精密量取上述SFE（CO2）提取液和醇回流提取液各50 mL，回收乙醇，残渣以50 mL氯仿溶解，用饱和NaHCO3溶液萃取4次（50 mL×4），合并碳酸氢钠溶液，用质量分数为36%的盐酸调节pH 2～3，用氯仿萃取4次（50 mL×4），合并氯仿液，减压蒸干，残渣用无水乙醇溶解并定容到50 mL，摇匀，分别得到灵芝超临界CO2流体萃取三萜类成分（supercritical fluid extraction and acidic components，SFE-AC）和灵芝醇回流提取三萜类成分（ethanol-soluble and acidic components，ES-AC）的供试液（每1 mL相当于原药材0.2 g）。

2.3 HPLC色谱图的比较

2.3.1 色谱条件 色谱柱:ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相:乙腈-0.05%磷酸;梯度洗脱，其时间程序为:0→40→60→80，乙腈体积分数相应为27%→27%→35%→45%;检测波长:257 nm，流速:1.0 mL/min，柱温:30℃，进样量:10 μL。

2.3.2 HPLC供试品溶液的制备 分别取SFE-AC供试液和ESAC供试液适量，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。HPLC图谱分别见图1和图2。

图1 灵芝超临界CO2流体萃取三萜类成分HPLC色谱

图2 灵芝醇回流提取三萜类成分HPLC色谱

因为在80 min后基本无色谱峰出现，说明三萜类成分在80 min内基本上已分离出来，所以选择分析时间为80 min。

由图1和图2可以看出，在样品进样浓度和体积相同的条件下，这两种提取方法所获得的HPLC图谱的出峰数量、保留时间基本保持相同，色谱峰峰形也极其相似。说明超临界CO2流体萃取和传统的醇回流提取这两种提取方法所提取出的目标产物基本一致。

2.4 灵芝酸B含量的比较

2.4.1 色谱条件 同2.3.1项下色谱条件。

2.4.2 标准曲线绘制［6］精密称取灵芝酸B对照品适量，置量瓶中，加甲醇适量使溶解，定容至5 mL，制成灵芝酸B质量浓度为0.475 mg/mL的高浓度对照品贮备液。吸取灵芝酸对照品高浓度贮备液适量，分别制成含灵芝酸B质量浓度分别为 0.047 5，0.095 0，0.142 5，0.190 0，0.237 5 mg/mL的对照品溶液;分别吸取各浓度对照品溶液10 μL进样，测定其峰面积。以对灵芝酸B对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得灵芝酸B标准曲线:Y=911.04X－3.758，r=0.999 9，结果表明，灵芝酸B在0.047 5～0.237 5 mg/mL呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度试验 精密吸取浓度为0.095 0 mg/mL的灵芝酸B对照品溶液10 μL，按2.3.1项下色谱条件重复进样5次，记录峰面积值，RSD为0.65%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批样品，平行制备5份供试品溶液，进样分析，计算灵芝酸B的含量，其含量的RSD为1.34%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h时间点进样分析，记录峰面积值，其RSD为0.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

对患者护理效果做护理问卷调查,主要分为以下三种结果:显效:指患者呕血、黑便等临床症状完全改善,出血现象停止;有效:指患者呕血、黑便等临床症状基本改善,偶尔有出血现象;无效:指患者呕血、黑便等临床症状没有改善,出血现象加重。总有效率=显效率+有效率。

2.4.6 灵芝酸B的含量测定 分别取SFE-AC供试液和ESAC供试液适量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，分别进样10 μL，计算灵芝酸B的含量，结果见表1。

表1 灵芝酸B的含量测定

从表1可以看出，超临界CO2萃取法和醇回流提取法对灵芝酸B的提取率相似，分别为0.363 mg/g和0.331 mg/g，其中以超临界CO2萃取法萃取的灵芝酸B含量稍高，但两者之间无显著性差异。

2.5 灵芝三萜含量的比较

2.5.1 对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品2.21 mg，置于10 mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，定容，摇匀，即得。

2.5.2 标准曲线的制备 参照文献［6］，精密吸取上述浓度为 0.221 mg/mL 的对照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分别置10 mL具塞试管中（同时吸取0.8 mL的无水乙醇作为空白对照），置沸水浴中挥干溶剂无水乙醇，再依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液各0.5 mL、再分别加入高氯酸各0.8 mL，密塞，置60℃水浴中加热15 min，取出，置冰水浴中冷却5 min，然后分别加冰醋酸5 mL，摇匀，以无水乙醇管作为空白对照，在543 nm处测定吸光度，以熊果酸对照品量（μg）为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，线性方程为:Y=0.005 9X+0.035 1，r=0.999 5，结果表明熊果酸在44.2～154.7 μg呈现良好的线性关系。

2.5.3 含量测定 分别取SFE-AC供试液和ESAC供试液各60 μL，按“2.4.2”项下方法测定吸光度，根据标准曲线计算灵芝三萜的含量，结果见表2。

表2 灵芝三萜的含量测定

从表2可以看出，超临界CO2萃取法和醇回流提取法对灵芝三萜的提取效率分别为1.33 mg/g和1.26 mg/g，提取效率以超临界CO2萃取法略高，但两者之间并无显著性差异。

2.6 固形物含量的测定

精密量取SFE-AC供试液和ESAC供试液各10 mL，置已干燥恒重的蒸发皿中，先放置沸水浴中挥干溶剂，然后再放置105℃烘箱中干燥至恒重，称定重量，计算固形物的含量，结果见表3。

表3 固形物含量的测定

从表3可以看出，超临界CO2萃取法和醇回流提取法所得得固形物含量分别为11.29 mg/g和16.30 mg/g，以醇回流法得到的固形物含量较高。

3 讨论

3.1 本文通过HPLC图谱、RP-HPLC法测定的灵芝酸B含量、可见分光光度法测定的灵芝总三萜含量、固形物含量等4个指标的比较，可知超临界CO2流体萃取法和醇回流提取法所得到的目标产物一致;灵芝酸B含量、灵芝三萜含量虽以超临界CO2萃取法稍高于醇回流提取法，但并无统计学差异，所以这两种提取方法所得的灵芝酸B含量、灵芝三萜含量相近;固形物含量以醇回流法较高，这表明该方法提取出的有效成分以外的杂质较多。综合以上4个指标的实验结果，可知这两种方法对灵芝中三萜类成分的提取效果相似，可以用超临界CO2萃取法取代传统的醇回流提取法提取灵芝子实体中三萜类成分。

3.2 三萜类化合物难溶于水，易溶于有机溶剂，所以灵芝三萜类成分的提取方法，除了本文中的以乙醇为溶剂进行提取，还可以用甲醇、氯仿等有机溶剂提取。但因甲醇、氯仿毒性比乙醇大，不宜用于工业化生产，故本文仅选择将乙醇回流提取和超临界CO2进行比较。

3.3 与传统溶剂提取法相比，超临界CO2流体萃取法具有突出的优点，萃取温度低，可有效防止热敏性物质的氧化和逸散;绿色无污染，不使用或较少使用有机溶剂，使用的CO2无味、无臭、无毒，安全性好;操作简单，萃取参数容易控制。

3.4 超临界CO2流体萃取法和醇回流法得到的提取物HPLC图谱极其相似，是因为以超临界CO2流体萃取法萃取灵芝子实体中三萜类成分时，使用乙醇作为夹带剂，改变了超临界CO2流体的极性。张洁等［9］也报道灵芝子实体超临界CO2流体提取物和甲醇提取物在高效液相色谱的色谱图中具有相似的峰形。

［1］黄书铭，杨新林，王帮武，等.灵芝醇溶酸性组分的抗肿瘤作用［J］. 天然产物研究与开发，2004，16（2）:146-148.

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［3］刘思妤，王 艳，何蓉蓉，等.灵芝的化学成分［J］.沈阳药科大学学报，2008，25（3）:183-187.

［4］袁 媛，杨 毅，开桂青，等.灵芝三萜提取工艺研究［J］.安徽化工，2007，33（4）:27-29.

［5］许海燕，侯敏娜，刘 剑.灵芝总三萜提取工艺研究［J］.陕西中医学院学报，2007，30（3）:43-44.

［6］宋师花，贾晓斌，陈 彦，等.超临界CO2萃取灵芝子实体中三萜类成分［J］.中国中药杂志，2008，33（17）:2104-2107.

［7］李保明，刘 超，王洪庆，等.灵芝总三萜酸含量测定方法的研究［J］.中国中药杂志，2007，32（12）:1234-1236.