珠子参饮片质量标准研究

2010-05-26宋小妹蔡宝昌

中成药 2010年5期

宋小妹，房方，蔡皓，蔡宝昌*

（1.南京中医药大学，江苏南京 210046;2.陕西中医学院，陕西咸阳 712046）

珠子参为五加科植物珠子参（Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng或羽叶三七Panax japonicusC.A.Mey.var.bipinnati-fidus（Seem）C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎。主产于四川、云南、贵州、甘肃、陕西、西藏等。具有补肺、养阴、活络、止血之功效，主要用于气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、外伤出血等症的治疗［1］。化学研究表明，珠子参主要活性成分为多种皂苷类［2］。药理实验表明皂苷类成分具有镇痛、镇静［3］、增强免疫力［4，5］、抗肿瘤［6］等活性。从现行各种标准来看，珠子参饮片的质量标准尚不完善。为此，本实验在对珠子参系统研究的基础上，以珠子参主要皂苷类成分人参皂苷Ro、竹节参皂苷IVa等为评价指标，对珠子参饮片进行质量评价研究，以保证其临床用药的安全有效。

1 实验材料

1.1 珠子参药材分别购于四川、云南、贵州、湖北等地。经陕西中医学院药学院王继涛高级实验师鉴定，为珠子参Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎。

1.2 珠子参饮片珠子参饮片为相应药材炮制的加工品（炮制方法:取原药材，挑出杂质，水洗，清水喷淋3次，放置5 h，切厚片。70℃干燥5 h，过筛，即得）。

1.3 仪器及试剂

1.3.1 仪器 Waters高效液相色谱仪;2996紫外检测器，Epower工作站;SB-3200D型超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，180 W，40 kHz）;BP-121S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.3.2 药品与试剂乙腈为色谱纯（SK Chemicals公司）;其余试剂均为分析纯;水为娃哈哈纯净水;人参皂苷Ro对照品、竹节参皂苷Ⅳa对照品（均为自制，经1HNMR、13CNMR、HMBC、HMQC 及 HR-MS确定结构;面积归一法计算含量均大于98%，符合含量测定要求）。

2 方法与结果

2.1 饮片性状本品为类圆形或不规则块片，直径0.2～1.8 cm。表面棕黄色或黄褐色，有皱纹;切面淡黄白色，粉性;或黄白色或黄棕色，略呈角质样。气微，味微苦、微甘。

2.2 粉末显微特征本品粉末黄白色、灰白色或棕黄色。木栓细胞表面观呈多角形，壁薄，非木化;切面观类方形，内含红棕色分泌物。草酸钙簇晶多，整个薄壁细胞组织均有分布，直径20～76 μm，棱角多宽钝，少数较尖。导管多为网纹，直径20～46 μm，螺纹、梯纹导管可见。

2.3 薄层色谱鉴别取本品粉末1 g，加甲醇30 mL超声处理40 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL加热溶解，水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，蒸干，残渣加甲醇5 mL加热溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Ro对照品、竹节参皂苷Ⅳa对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含2.0 mg的对照品溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，分别吸取竹节参皂苷Ⅳa对照品溶液、人参皂苷Ro对照品溶液各 2 μL，供试品溶液 2 μL 和/或 5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（5∶10∶0.5∶0.3∶3.5）上层液为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯（300 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图1。

2.4 检查

2.4.1 水分测定依照《中国药典》2005年版（一部）水分测定法（附录IX H第一法）进行测定。测定数据及结果见表1。

图1 珠子参饮片薄层色谱图1、8.分别为竹节参皂苷Ⅳa对照品、人参皂苷Ro对照品 2、3.四川样品溶液（点样量分别为2 μL、5 μL）4.云南样品溶液 5.贵州样品溶液 6、7.湖北样品溶液（点样量分别 2 μL、5 μL）Fig.1 TLC chromatogram of prepared pieces of Rhizoma Panacis majoris1、8.Chikusetsusaponin IVa and ginsenoside Ro reference substance 2-7.samples

表1 珠子参饮片中水分、灰分、酸不溶灰分及人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa含量Tab.1 Determination results of prepared pieces of Rhizoma Panacis majoris

2.4.2 总灰分依照《中国药典》2005年版总灰分测定法（附录IX K）进行测定。数据及结果见表1。

2.4.3 酸不溶性灰分测定依照《中国药典》2005年版一部总灰分及酸不溶性灰分测定法（附录IX K）进行测定。测定数据及结果见表1。

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件色谱柱:Kromasil Column C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流动相:乙腈-0.2%磷酸溶液（36∶64）;检测波长:203 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL;柱温:30℃;理论板数按竹节参皂苷Ⅳa峰计算应不低于3 000。

2.5.2 对照品溶液制备分别取竹节参皂苷Ⅳa对照品和人参皂苷Ro对照品适量，精密称定，加60%乙醇配制成竹节参皂苷Ⅳa 0.260 5 mg/mL，人参皂苷Ro 0.521 0 mg/mL的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液配制取珠子参粉末（过2号筛）约0.1 g，精密称定，加60%乙醇溶液30 mL，超声处理40 min，取出，加60%乙醇补足重量，滤过，取续滤液即得。

2.5.4 线性关系考察取上述对照品溶液，分别进样1、2.5、5、10、15、20 μL，测定峰面积，分别以人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程得:人参皂苷 Ro:Y=1.5×105X－7 909（r=0.999 9），竹节参皂苷Ⅳa:Y=3.2×105X－18 460（r=1）。结果表明，人参皂苷Ro在0.51～10.26 μg范围内、竹节参皂苷Ⅳa在0.26～5.21 μg范围内，峰面积Y与进样量（μg）X线性关系良好。

2.5.5 精密度试验取对照品溶液10 μL，照2.5.1项下色谱条件，重复进样6次，测定人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa峰面积。结果表明，本法精密度良好，人参皂苷Ro峰面积RSD为0.68%，竹节参皂苷Ⅳa峰面积RSD为1.07%。

2.5.6 稳定性试验取同一供试品溶液分别于0、2、4、8、12、18、24 h 内进样，照 2.5.1 项下色谱条件测定人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa峰面积。结果表明，供试品溶液在24 h内峰面积稳定，人参皂苷Ro峰面积RSD为0.68%，竹节参皂苷Ⅳa峰面积RSD为1.61%。

2.5.7 重复性试验取同一批号样品，平行称取6份，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，照2.5.1项下色谱条件测定人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa含量。结果表明，本法具有较好的重复性，人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa RSD分别为1.84%和1.93%。2.5.8 回收率试验取已知含量的样品5份，各0.1 g，精密称定，精密加入人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa对照品适量，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，按2.5.1项下色谱条件测定人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa含量。计算回收率，见表2、表3。结果表明，本法回收率良好，人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为0.46%和0.91%。

表2 人参皂苷Ro回收率试验结果Tab.2 Results of recovery test of ginsenoside Ro

表3 竹节参皂苷Ⅳa回收率试验结果Tab.3 Results of recovery test of chikusetsusaponin IVa

2.5.9 样品含量测定取不同批次样品粉末约0.1 g（各2份），精密称定，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，按2.5.1项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，计算含量，结果见表1。对照品和供试品HPLC图谱见图2。

图2 珠子参饮片HPLC图谱A.对照品 B.四川珠子参样品 C.湖北珠子参样品 1.人参皂苷Ro 2.竹节参皂苷ⅣaFig.2 HPLC chromatograms of prepared pieces of Rhizoma Pannacis majorisA.reference substances B.sample of sichuan C.sample of Hubei 1.ginsenoside Ro 2.chikusetsusaponin IVa