中药双龙片对实验性大鼠心肌梗塞的治疗作用

高 荣， 刘清飞， 李贻奎， 史 俊， 王义明， 罗国安*

（1.清华大学化学系，北京 100084;2.清华大学医学院，北京 100084;3.中国中医科学院西苑医院，北京100091;4.华东理工大学药学院，上海 200237）

双龙方是在中医药理论指导下，经过长期实验研究及对比精选所得的中药复方，由丹参和人参两味药材组成，具有“益气养血、活血通脉”功能，主治“胸痹”（气虚血瘀型），适用于冠心病（心绞痛、心肌梗塞）。药理研究表明双龙方对心肌梗塞模型大鼠有明显的治疗作用［1］。但双龙方为传统的汤剂，服用不便，为此，我们提取人参和丹参药材中的有效部分人参总皂苷和丹参总酚酸，按双龙方的药材配比制成片剂双龙片。本实验以大鼠冠状动脉结扎致心肌梗塞模型，通过心肌梗塞面积测定、血清酶学指标测定及梗塞区边缘血管面密度测定来研究双龙片对心肌梗塞的治疗作用，并为今后的临床用药提供理论依据。

1 实验材料

1.1 动物

Wistar大鼠，SPF 级，♂性，体重 210 ～230 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（SCXK（京）2007－0001）。

1.2 药物与试剂

双龙片，自制，批号:20090313;麝香保心丸上海和黄药业有限公司，批号:081106;盐酸地尔硫䓬片，浙江亚太药业股份有限公司，批号:080903;肌酸激酶（CK）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号:20090326;乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号:20090326;Ⅷ因子兔多克隆抗体，购自美国R＆D公司，批号:V58401;羊抗兔IgG二抗，北京中杉金桥公司，批号:PV－6000;CMC－Na，北京华奇盛生物技术发展中心，批号:A10648;水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号:T20061114;甲醛，北京益利精细化工公司，批号:20080728。

1.3 仪器

LeicaRM2145切片机，德国 Leica公司生产;Olympus bx51光学显微镜，日本Olympus公司生产;Anymicro DSS图像分析系统，北京裕天世纪伟业公司生产。

2 方法

2.1 动物造模［2］

140只大鼠实验室条件饲养2 d后，用3.5%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，胸部去毛消毒，沿着锁骨中线纵行切开皮肤约2 cm，在第3或第4肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏。在动脉圆锥与左心耳之间、左心耳根下部2～3 mm处穿线，结扎冠状动脉处左冠状动脉前降支后，把心脏放回胸腔，挤压排除胸腔空气，撒入约20万单位的青霉素冻干粉，迅速缝合胸腔。假手术组除不结扎冠脉前降支外其余操作同模型组。

2.2 分组及给药

将手术后麻醉苏醒的76只冠脉结扎大鼠，随机分为6组，每组12～13只:双龙片高、中、低剂量组（给药剂量分别相当于5 g生药/kg、2.5 g生药/kg、1.25 g生药/kg，片剂研磨成细粉后用0.5%CMCNa溶液分别配置成混悬液）;阳性对照药麝香保心丸组（50 mg/kg，丸剂研磨成细粉后用0.5%CMCNa溶液配置成混悬液）;阳性对照药盐酸地尔硫䓬片组（50 mg/kg，片剂研磨成细粉后用0.5%CMCNa溶液配混悬液）;模型对照组（给予10 mL/kg的0.5%CMC－Na溶液）。另外将假手术后麻醉苏醒的开胸大鼠10只作为假手术组，10只未做任何处理的大鼠作为正常对照组，均给予10 mL/kg的0.5%CMC－Na溶液。以上各组大鼠在手术后第2天开始灌胃给药，每天1次，连续给药14 d。14 d后麻醉大鼠，开腹取下腔静脉血，离心分离血清备用;后开胸取心脏，生理盐水洗净后立即用10%的福尔马林固定。

2.3 血清酶学测定

取大鼠血清，分别按肌酸激酶（CK）测定试剂盒和乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒的要求进行测定，并计算CK和LDH的活力值。

2.4 心肌病理观察及梗塞面积测定

取固定后大鼠心脏，沿左室短轴横切5片，经常规脱水、透明、每片用石蜡包埋制蜡块，制成5 μm厚的切片、苏木素－伊红（H－E）染色，光镜下观察心肌坏死情况。用Anymicro DSS图像分析系统在10倍物镜显微镜下检测每个切片的左室面积和心肌梗塞面积（梗塞区与非梗塞区的界定为:梗死灶边缘可见充血带及中性粒细胞浸润，心肌细胞肿胀，胞浆内出现颗粒状物及不规则横带），计算心肌梗塞总面积与左室总面积，梗塞面积（%）用心肌梗塞总面积/左室总面积×100%表示。

2.5 梗塞边缘区心肌血管面密度检测

取2.4项操作所制第3片心肌的蜡块，制成5 μm厚的切片，按标准化技术进行心肌组织VⅢ因子免疫组化染色操作，其切片经Anymicro DSS图像分析系统处理，测量左室梗塞边缘区显示有VⅢ因子阳性染色的血管（×200）数目，每张切片随机观察5个视野，取均数，再根据测量窗面积即可算出每平方毫米的血管数目即面密度。

2.6 统计分析

3 结果

3.1 造模及动物死亡情况

本次实验共用去150只大鼠，其中140只造心肌梗死模型和开胸做假手术，手术后造模大鼠存活76只，假手术大鼠存活10只。造模存活的76只大鼠中，分配到模型对照组13只，饲养过程中死亡5只;分配到双龙片高剂量组13只，饲养过程中死亡2只;分配到双龙片中剂量组13只，饲养过程中死亡4只;分配到双龙片低剂量组13只，饲养过程中死亡4只;分配到麝香保心丸组12只，饲养过程中死亡1只;分配到盐酸地尔硫䓬组12只，饲养过程中死亡5只。正常对照组10只和假手术组10只大鼠均未死亡。

3.2 双龙片对血清CK、LDH的影响 见表1。

表1 双龙片对心肌梗塞模型大鼠的血清酶学CK、LDH的影响（±s）

表1 双龙片对心肌梗塞模型大鼠的血清酶学CK、LDH的影响（±s）

与模型对照组相比，*P ＜0.05，**P＜0.01;与正常对照组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组别 剂量/（g/kg） 样本量/个 CK/（U/L） LDH/（U/L）模型对照组 — 9 2 152.2±433.5## 15 595.1±2 748.3##正常对照组 — 10 806.6±531.1 8 278.9±3 196.6假手术组 — 10 1 364.6±353.4**# 8 821.1±4 071.7**双龙片高剂量组 5 11 856.2±322.7** 9 019.1±2 204.2**双龙片中剂量组 2.5 9 929.1±662.4** 10 935.7±2 403.2**双龙片低剂量组 1.25 9 1 397.5±840.0* 11 555.6±3 742.3**麝香保心丸组 0.05 11 1 263.8±603.3** 11 885.2±5 131.0*盐酸地尔硫䓬组 0.05 7 1 368.2±389.2** 12 430.8±1 693.3*

结果表明，与正常对照组相比，模型对照组 LDH、CK值显著升高（P＜0.01），说明冠状动脉结扎所致的心肌梗塞可导致大鼠血清中的LDH、CK的活性显著升高，造模成功;假手术组的CK值与模型对照组和正常对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），说明开胸手术能够显著升高CK活性，但其升高程度不如冠脉结扎;与模型对照组相比，各给药组 LDH、CK值差异均有统计学意义（P＜0.05），与正常对照组相比各给药组的LDH、CK值差异均无统计学意义（P＞0.05），各给药组相互之间的LDH、CK值差异均无统计学意义（P＞0.05），以上说明各剂量的双龙片均能够将冠脉结扎大鼠的LDH及CK活性降至正常水平的作用，其疗效与阳性对照药麝香保心丸相当。

图1 心肌梗塞模型大鼠治疗组、对照组及假手术组的心肌病理切片

3.3 心肌病理观察

结果见图1:模型组梗塞区心肌细胞重度水肿，见灶状、片状坏死，纤维化，钙化，间质水肿，大量炎细胞浸润，血管扩张充血，间质出血明显，提示造模成功;假手术组从整体来看心肌细胞横纹排列整齐，心肌细胞横纹肌和细胞核正常，但有少量炎细胞浸润，可能为心脏穿孔留线所致。双龙片各剂量组及两阳性药对照组病理改变介于模型对照组和假手术组之间，其中双龙片高剂量组与麝香保心丸组心肌病理改变状况明显轻于其他给药组。

3.4 心肌梗塞面积

结果见表2。双龙片各剂量组与阳性对照药麝香保心丸组的心肌梗塞面积均小于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明双龙片各剂量和麝香保心丸均有改善心肌梗塞面积的作用;阳性对照药盐酸地尔硫䓬有缩小心肌梗塞面积的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），说明其改善心肌梗塞的的疗效不如双龙片和麝香保心丸;假手术组无梗塞面积。

表2 双龙片对心肌梗塞模型大鼠心肌梗塞面积的影响（±s）

表2 双龙片对心肌梗塞模型大鼠心肌梗塞面积的影响（±s）

与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01;与盐酸地尔硫䓬相比，#P ＜0.05。

组别 剂量/（g/kg）样本量/个 梗塞面积/%模型对照组 —9 22.04±3.84假手术组 — 10 0双龙片高剂量组 5 11 9.16±1.37**#双龙片中剂量组 2.5 9 9.43±2.32**双龙片低剂量组 1.25 9 11.14±4.38*麝香保心丸组 0.05 11 9.68±0.67**盐酸地尔硫䓬组0.05 7 16.05±3.71

3.5 梗塞边缘区心肌血管面密度

结果见表3，模型对照组与假手术组相比，梗塞边缘区心肌血管面密度差异无统计学意义，说明心肌梗塞后尚不能自发形成代偿性血管新生;各给药组梗塞边缘区心肌血管面密度均高于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明双龙片各剂量与两个阳性对照药均有促进梗塞区心肌血管新生的作用;而双龙片高剂量组与麝香保心丸组心肌血管面密度均高于盐酸地尔硫䓬组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明双龙片高剂量与麝香保心丸的促血管新生作用要强于盐酸地尔硫䓬，双龙片中低剂量促血管新生作用与盐酸地尔硫䓬相当。

4 讨论

急性心肌梗塞的诊断基于WHO的标准，包括下列三项中的二项——临床症状、心电图异常和血清中LDH、CK及其同工酶异常。心肌梗塞后心肌严重缺血、缺氧使细胞内的LDH、CK释放入血循环，造成血中LDH、CK活性明显升高，其升高程度与心肌坏死程度呈正比，故可通过测定血清中LDH、CK的的活性反应心肌组织受损情况［3］。本实验结果表明，双龙片各剂量组均能显著降低冠脉结扎致心肌梗塞大鼠的LDH及CK活性，从而对缺血心肌具有保护作用。

表3 双龙片对心肌梗塞模型大鼠梗塞边缘区新生血管的影响（±s）

表3 双龙片对心肌梗塞模型大鼠梗塞边缘区新生血管的影响（±s）

与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01;与盐酸地尔硫䓬组相比，#P ＜0.05。

组别 剂量/（g/kg）样本量/个 心肌血管面密度/（个/mm2）模型对照组 —9 51.1±18.3假手术组 — 10 50.2±12.9双龙片高剂量组 5 11 111.5±13.3**#双龙片中剂量组 2.5 9 86.8±13.3**双龙片低剂量组 1.25 9 97.9±13.5**麝香保心丸组 0.05 11 114.9±3.0**#盐酸地尔硫䓬组 0.05 7 77.5±9.7*

有文献报道在研究大鼠心肌梗塞模型时，假手术组的心肌病理镜下观察也出现了少部分心肌坏死，出现了假阳性的心肌梗塞区，其原因是其采用颈椎脱臼法处死大鼠后心脏仍然跳动，心肌缺氧而导致部分心肌坏死［4］。本研究是在大鼠麻醉状态下活体取心脏并立即用福尔马林固定，假手术组并未观察到心肌坏死现象，从而避免了假阳性的心肌梗塞的发生。

冠脉侧枝循环的建立能减轻心肌缺血坏死、预防和延缓缺血性心脏病和室壁瘤形成、改善临床症状和预后，它包括原有侧枝的开放和新侧枝的形成。血管面密度是直接反映侧枝血管形成最可靠的解剖学指标，梗塞范围也间接反映侧枝循环情况，梗塞面积越小，说明侧枝循环越丰富［5］。已有研究表明，麝香保心丸能促进冠脉侧枝血管的生成，具有保护缺血心肌，减小梗塞范围的作用［4，5］，本研究证实，双龙片具有麝香保心丸的同等疗效。研究发现人参皂苷中的单体成分Rg1、Re等具有血管生长因子样作用［6，7］，这是双龙片能促进冠脉侧枝循环的有力佐证。

双龙片由丹参和人参药材提取的有效部分丹参总酚酸和人参总皂苷组成，人参总皂苷有增加冠脉血流、减少心肌耗氧的作用，丹参总酚酸的主要组成成分丹参素有抗心肌缺血、抗血小板、抗血栓形成作用［1］，两者合用可降低心肌耗氧，增加冠脉血流量等作用，使心肌能量消耗下降，有利于调节和维持心肌氧代谢和能量的供需平衡，改善心肌的血氧供应，从而缓解心肌梗塞所致的心肌损害。

一般认为，血液循环中的干细胞可以定向到达梗塞心肌并参与组织再生与微环境（包括细胞因子及生长因子的分泌表达）有关，即“环境诱导分化”理论，同时新生的心肌细胞通过分泌某些细胞因子及生长因子进一步改善心脏的灌注和功能［8］，双龙片的主要成分人参皂苷Rb1和丹参酚酸B能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞［9］，从而修复梗死心肌，减少梗塞面积，达到逆转心室重构和提高心脏功能的目的。

本研究结果表明，双龙片可降低冠状动脉结扎大鼠的血清CK、LDH酶学活性，减轻心肌损伤程度，修复梗塞区心肌从而缩小心肌梗塞范围，同时可促进梗塞边缘区心肌小血管生成，增加心肌供血，证明双龙片对大鼠冠状动脉结扎之心肌梗塞有明显的治疗作用。

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