枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白的分离纯化及对烟草青枯病菌的抑制作用

张秀玉，孔凡玉，王 静，张成省，李佰乐

(国家烟草专卖局烟草病虫害监测与综合治理重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101)

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为植物病害主要生防细菌之一，广泛分布于自然界中，因其是对人畜无害、不污染环境的非致病细菌，备受各国研究工作者的青睐。很多优良的枯草芽孢杆菌菌株已经应用于农业生产[1-3]。Bacillus subtilis 在生长代谢过程中能够产生不同种类的拮抗物质，主要为抗生素和抗菌蛋白[4-5]。国内对Bacillus subtilis及其代谢产物对植物病原菌的生物防治研究也很多，主要对不同 Bacillus subtilis 菌株抗菌蛋白的分离、纯化、理化性质及其抑菌机制的研究[6-7]。

从烟草根际土壤分离到 1株对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有较强拮抗作用的生防细菌SH7(经细菌常规及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌[8])，且其无菌发酵液对烟草青枯病的温室盆栽试验防效较好，并初步证明了该菌产生的拮抗物质为蛋白类物质[9]。本实验对SH7菌株产生的拮抗蛋白进行分离纯化，并初步研究了该抑菌蛋白对Ralstonia.solanacearum的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

拮抗菌株： Bacillus subtilis SH7，分离自烟草根际土壤。

指示菌：Ralstonia solanacearum，来自中国科学院植物保护研究所。

1.2 供试培养基

基础发酵培养基（NB）：每升水含葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，pH 7.0。牛肉膏蛋白胨淀粉培养基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g氯化钠，2 g淀粉，20 g琼脂，1000 mL水，pH 7.4。

淀粉酶种子培养基：5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCL，5 g可溶性淀粉，1000 mL水，pH7.0。

淀粉酶发酵培养基：20 g玉米粉，15 g黄豆饼粉，0.2 g氯化钙，0.2 g硫酸镁，2.5 g氯化钠，2g磷酸氢二钾，0.75 g硫酸铵，2 g磷酸氢二钠，1000 mL水，pH7.0。

1.3 主要试剂

酵母粉、蛋白胨购自OXOID有限责任公司，DEAE Sepharose Fast Flow购自GE Healthcare公司，Sephadex G-75购自Pahaimacia公司，丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、聚乙二醇 8000购自北京索莱宝科技有限公司，低分子量标准蛋白购自天根生化科技有限责任公司，其余试剂为国产分析纯。

1.4 粗提拮抗物的确定

将SH7接种于含100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃振荡培养48 h，4 ℃下8000 r/min离心15 min去菌体，在上清液中加入硫酸铵至30%,50%, 70%, 90%不同饱和度，将各级沉淀所得蛋白透析脱盐即为蛋白粗提液，牛津杯扩散法法检测其对R.solanacearum的活性测定。

1.5 抑菌蛋白的分离纯化

1.5.1 抑菌蛋白的分离 将有活性的蛋白粗提液用上样缓冲液( 0.02 mol/L Tris-HCL, pH 8.0 ) 充分透析后, 进行DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，再用含0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mol/L的氯化钠的缓冲液进行梯度洗脱，分部收集样品，透析脱盐，检测对烟草青枯病菌的抑菌活性。

1.5.2 抑菌蛋白的纯化 将有抑菌活性的收集样品浓缩再进行Sephadex G-75凝胶过滤层析，用500 mL 0.02 mol/L Tris-HCL洗脱，收集样品，透析脱盐后检测其对烟草青枯病菌的抑菌活性，-25 ℃保存备用。

1.5.3 抑菌蛋白纯度与相对分子质量测定 方法参照文献[10]。聚丙烯凝胶电泳浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，分别在80 V和100 V下做恒压电泳。染色采用考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色法[11]相结合。

1.6 抑菌蛋白淀粉酶活力的测定

将 1.5.2中具有活性的蛋白利用牛津杯定量扩散法在牛肉膏蛋白胨淀粉培养基上培养24 h，利用革氏碘液(1.0 g碘，2.0 g碘化钾，300 mL水)显色法，测定活性蛋白是否具有淀粉酶活性。再用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶活力。

1.7 抑菌蛋白对烟草青枯病菌的拮抗作用

在100 mL NB液体发酵培养基的250 mL摇瓶中按 1:20的接种量同时接入抑菌蛋白和烟草青枯病菌，30 ℃摇床中150 r/min培养48 h；同时设相同条件下培养烟草青枯病菌为对照，每处理3次重复；8000 r/min离心 15 min去菌体；以 V(上清液):V(无水乙醇)=1：3加入乙醇，混匀，静止过夜，在12000 r/min下离心2 min，弃上清，用75%乙醇冲洗沉淀[12]，在50 ℃烘箱中放置6 h，烘干后剩余沉淀即为胞外多糖粗提物，分别测定其质量。

2 结 果

2.1 抑菌蛋白的分离纯化

2.1.1 硫酸铵饱和度的确立 抑菌蛋白粗提液经硫酸铵分级沉淀透析脱盐后，通过对烟草青枯病菌的活性测定，得知在 0～30%沉淀段的蛋白对烟草青枯病菌的抑菌活性最大，而 30%～50%，50%～70%和 70%～90%基本没有抑菌活性，表明此饱和度沉淀出来的蛋白多为杂蛋白，不含抗菌蛋白，由此确定分级盐析的饱和度为0～30%。

2.1.2 抑菌蛋白纯度与相对分子质量测定 经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析，对有活性的蛋白进行非变性胶聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色得单条带，蛋白的相对分子质量为 33.6 kD (图 1)。

2.2 抑菌蛋白淀粉酶活力的测定

利用革氏碘液显色，由图2可以看出，抑菌蛋白具有淀粉酶活力，是一种胞外蛋白酶。经碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力为15.76 mg/mL。

图1 枯草芽孢杆菌SH7纯化抑菌蛋白的SDS-PAGE电泳Fig.1 SDS-PAGE pattern of purified protease from Bacillus subtilis strain SH7

2.3 抑菌蛋白对烟草青枯病菌抑制作用

单独接烟草青枯病菌得到的胞外多糖含量为0.62 mg/mL，而同时接活性蛋白和烟草青枯病菌得到的胞外多糖含量为0.46 mg/mL，小于单独接烟草青枯病菌的胞外多糖含量，从而可以看出抑菌蛋白抑制了烟草青枯病菌分泌胞外多糖的量。

3 小 结

本实验纯化了电泳纯的SH7分泌的抑菌肽，其相对分子质量为 33.6 kD，且具有淀粉酶的活性，能减少烟草青枯病菌胞外多糖的分泌。对于生防芽孢杆菌产生的抑菌肽类对植物病原菌的拮抗作用，国内外已有较多研究[13-15]，而对其具有淀粉酶活性的研究还较少，SH7分泌的抑菌肽的淀粉酶活力与胞外多糖的减少是否相关有待进一步研究。同时作者已证实SH7菌株对烟草具有促生作用，对其他作物青枯病菌、烟草黑胫病和烟草赤星病菌具有良好的拮抗作用(另文报道)，本实验为以后对抑菌肽的进一步纯化、测序及构建多功能生防菌株奠定了基础，为SH7菌生防制剂的产业化及田间应用提供了理论依据。

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