海带多糖对肾上腺素致内皮细胞超微结构损害的保护作用*

谢 露，王丽萍，陈蒙华，黎 静

(1.广西医科大学生理学教研室，2.广西医科大学附属医院心血管病研究所，南宁 530021)

血管内皮细胞是血液与血管组织间的一道半通透屏障，具有非常重要的保护和分泌调节功能，如维持血管内皮依赖性舒张活性，调节血管的收缩和舒张，维持凝血和抗血栓功能的平衡，使血管内膜表面无血栓形成。内皮细胞受损会引起上述生理作用减弱或丧失，因此，保护内皮细胞免受损害或逆转或改善内皮细胞功能障碍在血栓性疾病的防治中具有重要意义。我们通过实验研究发现，海带多糖(PL)L01对大剂量肾上腺素引起的大鼠血管内皮细胞损伤有保护作用，从而保护其抗血栓功能【1】。本研究通过观察肾上腺素对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical venousendothelial cell，HUVEC)超微结构的损害及海带多糖的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞株购于上海午立公司，由本研究室自行传代。肾上腺素注射液(广州明兴制药厂)。DMEM培养基干粉(Gibco公司)。小牛血清(杭州四季清生物工程公司)。胰蛋白酶(DIFCO公司)。3111CO2培养箱(Thermo Forma)。1450超净工作台(苏州市黄浦空调净化设备有限公司)。XSB-1A倒置显微镜(梧州光学仪器厂)。BD-211电子天平(SATORIOUS，德国)。日立H500型投射电镜(日本)。

1.2 实验步骤

1.2.1 海带多糖制剂 海带干粉，加水调浆，先经纤维素酶和中性蛋白酶水解，后经盐酸浸泡、乙醇沉淀得海带多糖粗品。粗品经DEAE-纤维素柱分离得到含量最高的组分。

1.2.2 人脐静脉内皮细胞的培养和分组 取HUVEC细胞株(4～10)×104cells/ml接种于D MEM培养基(含 10%小牛血清，青、链霉素各100U/ml)中，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，隔天换半液，生长至融合状态，倒置显微镜下观察细胞呈单层铺路石状镶嵌排列，用0.25%胰酶消化传代培养，取对数生长期用于实验。将HUVEC用0.25%胰蛋白酶消化，以5×104cells/cm2密度接种于24孔板中，培养24h后换液，分组:正常组(不加药物)、Adr组(10μg/ml Adr)、PL 组(0.1 mg/ml PL)、低剂量PL(L-PL)+Adr组(0.01 mg/ml PL+10μg/ml Adr)，高剂量 PL(H-PL)+Adr组(0.1 mg/ml PL+10μg/ml Adr)。每组8孔。

1.2.3 电镜标本的制备 HUVEC接种后24h弃去培养液，用低浓度胰酶消化，移入离心管，1000～1500r/min离心5～10min，吸弃上清液，加入胎牛血清 1滴，然后吹散离心物使其混合，再离心3～5 min，吸弃上清。用 2%戊二醛固定后，再用锇酸固定。梯度乙醇脱水，Epon 812树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅及醋酸铀双染色，日立H500透射电镜下观察。

2 结果

2.1 电镜下各组HUVEC细胞核形态

正常组细胞核类圆形，核膜完整，核仁圆润、清晰。Adr组细胞核形态不规则，核表面呈现多处突出或向内凹陷，核仁固缩、边界模糊。PL组和H-PL+Adr组细胞核形态与正常组比较无明显改变。L-PL+Adr组细胞核形态不规则，表面有凹陷，核仁固缩，但边界清晰(图1)。

2.2 电镜下各组HUVEC线粒体形态

正常组线粒体结构完好，嵴清晰可见。Adr组线粒体肿胀，嵴消失，空泡化。PL组和H-PL+Adr组线粒体形态与正常组比较无明显改变。L-PL+Adr组线粒体无肿胀，嵴依稀可见，内有空泡(图2)。

Fig.1 Electron micrograph of HUVEC in five groups showing nuclear contour(×2.8 k)

Fig.2 Electron micrograph of HUVEC in five groups showing mitochondria contour(×3 k)

3 讨论

我们实验研究发现，Adr与HUVEC共培养后，对细胞核和线粒体的损害明显，这与其代谢产物的毒性作用有关。Adr可在A型单胺氧化酶作用下，脱氨生成甲胺，后者在氨基脲敏感胺氧化酶作用下生成甲醛、过氧化氢和氨，这三种产物具有很强的细胞毒性【2，3】。细胞核和线粒体损伤将使内皮细胞能量代谢、活性物质表达发生严重障碍，失去其原有的生理功能。实验中单独加入PL，对HUVEC超微结构无明显影响，加入PL+Adr后，HUVEC超微结构改变情况与PL剂量相关，L-PL+Adr组的细胞核形态明显变形，线粒体内有空泡，而H-PL+Adr组细胞核和线粒体结构都完好，说明 PL能够拮抗Adr和(或)脱氨产物对HUVEC细胞核、线粒体超微结构的损害。

我们在前一阶段的研究中发现海带多糖能够拮抗注射Adr引起的大鼠内皮损伤，形态学观察可见，给药组内皮细胞脱落、损失较轻，完整内皮长度明显大于模型组【1】。在本研究中，我们深入观察Adr对HUVEC的超微结构的损害及海带多糖的保护作用，结果进一步说明了海带多糖能够保护血管内皮细胞的结构完整性，因此可维护其调节血管张力、止血与抗凝血平衡等正常生理功能。海带多糖是否能够减少Adr代谢产物生成或是能够阻止代谢产物进入细胞产生毒性作用?其作用机理还有待于探讨。

[1]谢 露，刘爱群，黎 静，等.海带多糖对肾上腺素致血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中国应用生理学杂志，2007，23(2):143-146.

[2]Boor P，Trent M B，Lyles G A，et al.Methylamine metabolism to formaldehyde by vascular semicarbazide-sensitive amine oxidase[J].Toxicol，1992，73(3):251-258.

[3]Yu P H，Lai C T，Zuo D M.Formation of formaldehyde from adrenaline invivo;a potential risk factor for stress-related angiopathy[J].Neurochem Res，1997，22(5):615-620.