NF-κB“圈套”抑制PC12细胞中NF-κB活性模型的建立*

王冬梅，宫德正，殷盛明，于德钦，徐 红，徐 静，赵 杰，孙艺平，△

(1.大连医科大学机能学实验室，辽宁 大连 116044;2.大连医科大学生理教研室，辽宁 大连 116044)

核转录因子(NF-κB)的激活可高效诱导靶基因的转录，在炎症和免疫反应中起着调控作用。目前有关抑制NF-κB活化的“圈套”策略已在心脏再灌注损伤、肾小球性肾炎等炎症性疾病的动物实验中显示疗效[1]。本研究将利用具有神经元细胞模型特点的PC12细胞，以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为NF-κB的活化剂 ，观察κB-decoy 对NF-κB的抑制作用 ，以建立NF-κB“圈套”对PC12细胞中NF-κB抑制的模型，为探讨由NF-κB过度活化导致的神经系统某些疾病的基因防治措施提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 κB-decoy的设计与合成

根据NF-κB增强子的特定序列5'-GGGACTTTCC-3'，设计包含2个拷贝的NF-κB特异结合序列的哑铃形圈套寡核苷酸和与其碱基数相同的随机序列(大连宝生物公司)。

1.2 载体包裹寡核苷酸

按比例以每孔(6孔板)15μl LF2000(Invitrogen)溶于 375μl无血清的 Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen)中室温充分混匀5 min;将DNA(6μg/well)溶于 375μl无血清的 Opti-MEM I Reduced Serum Medium中;将以上两种溶液混合，室温孵育20min。

1.3 PC12细胞处理

转染前24h，将7.5×105个PC12细胞溶于2 ml生长培养基中，之后接种于6孔板中(用于免疫细胞化学染色实验的需铺盖玻片)，最终使接种浓度达到90%;细胞24h贴壁后换液(正常1640无双抗培养液，2 ml/well);将细胞分3组进行处理，实验组:LF2000+κB-decoy;对照组 :LF2000+错配-decoy;正常组:LF2000;每孔加入1.2中的混合液750μl混匀;将6孔板放于37℃的CO2培养箱，细胞转染24h后更换正常无双抗培养液(2 ml/well)，继续培养24h。

细胞转染48 h后，稀释LPS(200ng/ml)，作用0.5～4h。

用于Western blot方法检测的细胞:吸去培养液，1×PBS洗2遍，1×Loading Buffer刮板收集细胞，加入 200μl 1 ×Loading Buffer/well，漩涡振荡，煮样10min，12000×g 4℃离心10min，-20℃保存备用。

用于免疫细胞化学染色实验的细胞，将爬满细胞的盖玻片以0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次后，冷丙酮固定20min，-20℃保存。

1.4 免疫细胞化学染色

将爬满细胞的盖玻片以0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，用1%H2O2作用10min，5%羊血清(含有0.3%triton-100的PBS)封闭20min，加一抗NF-κBp65(Santa Cruz)1∶100，在湿盒中 4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，再分别与二抗(1∶400)室温孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，与卵白素-生物素复合物室温孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，DAB显色 5～10min，显微镜下观察适时终止反应，常规脱水、透明、中性树胶封片。

1.5 Western blot分析

按照蛋白提取试剂盒说明书提取PC12细胞内总蛋白采用 Bradfold法进行蛋白定量，以 100μg蛋白质为标准，算出所需原液体积，补加1×PBS使总体积为15μl，再向每个样品管中加 5μl的 4×Loading Buffer混匀，蛋白于100g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，加NF-κB p65抗体(1∶500)，4℃过夜，将PVDF膜在33℃条件下结合二抗(1∶3000)1 h，ECL显色，照片采用凝胶成像系统进行密度分析。

1.6 图像分析

使用Nikon显微摄影系统及NIS-Elements F2.30分析软件对其免疫反应产物进行平均光密度(Mean density)测定，以细胞为单位(n=30)，选择图像中棕黄色区域。

1.7 统计学分析

使用Excel、SPSS 13.0软件进行数据分析，计量资料数据以平均值±标准差()表示，两组间差异显著性采用t检验(t-TEST)，多组间差异采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 免疫细胞化学染色

正常组:基础水平时，细胞胞浆无色或呈微棕色、胞核无棕色染色;经LPS刺激4h后，胞浆呈浅棕色或棕色，胞核呈棕色或深棕色染色，NF-κB活化明显(P＜0.01)。对照组(转染错配-decoy):基础水平时NF-κB p65表达水平与正常培养的PC12细胞相似;以LPS刺激0.5～4h，随着时间的延长，细胞中胞浆染色由浅棕色逐渐增加至深棕色、胞核由无或浅棕色逐渐增加至棕黄色，2 h时NF-κB p65的表达至最高水平，4h时有所下降;实验组(转染κB-decoy):基础水平时胞浆与胞核均无棕黄色染色，以LPS刺激0.5～4h，随着时间的延长，胞浆与胞核染色均逐渐增加至浅棕或微棕色，2 h时达最高水平，4h时有所下降;与相应时间点的对照组相比，NF-κB p65的表达水平明显降低(P＜0.01)，2～4h最为明显(图1)。

2.2 Western blot分析

正常组与对照组的 PC12细胞中 NF-κB p65 Western blot分析的阳性信号较弱;实验组与正常组和对照组相比明显降低(P＜0.01);正常组细胞经LPS刺激 4h 后，NF-κB p65 Western blot分析的阳性信号比基础水平明显增强(P＜0.01);对照组的PC12细胞经LPS刺激4h后比基础水平明显增强(P＜0.01)，与正常组相似;实验组的PC12细胞经LPS刺激4h后比基础水平明显增强(P＜0.01)，与对照组相比明显降低(P＜0.01，图2)。

3 讨论

NF-κB作为一种普遍存在的转录因子，是多种信号传导途径的汇聚点。近年来的研究发现，NF-κB过度活化与神经系统某些疾病的炎症反应有着密切关系[2-4]，因此探讨和研究抑制NF-κB的活化对神经系统某些疾病的炎症反应，特别是对神经退行性疾病中的脑保护作用具有一定意义。

Fig.1 Immunocytochemistry of NF-κB in PC12 cells(×100，×400)

Fig.2 Western blot analysis of NF-κB expression in PC12 cells A:Western blot;B:Relative optical density of the Western blot analysis

PC12细胞株最早是由Greene和Tischler从大鼠移植的嗜铬细胞瘤(肾上腺)中获得[5]，在神经生长因子(nerve growth factor，NGF)诱导下，PC12细胞能长出大量轴突、分化成交感神经样细胞，而且神经样分化的PC12细胞具有大多数神经元的形态、生化和生理特性[6]，因其具有可传代培养的特点，作为神经元细胞模型，可用于神经生理、病理及药理方面的研究。近年来，PC12细胞作为神经系统损伤的细胞模型，已被广泛应用于神经元的毒性损害的研究[7，8]。

拮抗 NF-κB的策略有多种，只有对NF-κB与DNA顺式元件的结合实施直接干预措施，才能达到真正的特异性。“圈套”策略则是合成与顺式元件相一致的双链寡聚脱氧核苷酸转染入细胞，竞争性抑制反式因子(转录因子)与顺式元件的结合，干扰转录因子的DNA结合活性及其后续基因的表达，所以“圈套”策略已成为拮抗NF-κB活性的最佳选择之一。自1996年第一个经美国药品和食品管理局(FDA)批准的转录因子E2F“圈套/诱骗”策略用于治疗血管旁路移植伤后新生内膜增生患者以来，许多研究已报告了该策略作为体内基因治疗效果[1]。目前有关NF-κB“圈套”策略已应用于与NF-κB过度活化相关疾病，如心脏再灌注损伤、肾小球性肾炎等炎症性疾病的治疗，其动物实验已显示出确切而显著的疗效[9，10]。

在本研究中，依据NF-κB增强子的特定序列5'-GGGACTTTCC-3'设计包含2个拷贝的NF-κB特异结合序列的哑铃形圈套寡核苷酸转染PC12细胞后，可明显降低NF-κB的基础表达水平，再以LPS刺激PC12细胞活化NF-κB，可明显抑制NF-κB的活化;提示κB-decoy可以降低生理状态下PC12细胞中NF-κB的正常表达水平，抑制病理状态下PC12细胞中NF-κB的活化。此细胞模型的建立为我们深入探讨NF-κB对下游基因表达调控奠定了基础，也为抑制脑内NF-κB活化基因疗法提供了实验依据。

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