不同种属坐骨神经的结构差别

王 鑫,彭 江,王 玉,任志午,赵 斌,张 莉,许文静,赵 喆,詹胜锋,卢世璧,赵 庆

(中国人民解放军总医院,北京 100853)

同种异体神经移植作为修复周围神经缺损的一种修复材料,由于具有天然的与受区一致的管状结构和细胞外基质成分而得到关注,但其含有的抗原成分是阻止其广泛应用主要因素。我们先前的研究中,采用了 Hudson法去除了大鼠坐骨神经中的免疫原性成分,还能更好地保留神经结构的完整性[1],但对于猪、灵长类和人这样加大型的哺乳动物,神经明显增粗,其结构也不尽相同[2]。2009年 1～9月,我们通过体外实验对比观察人、犬、猪、大鼠坐骨神经结构的差别,旨在为粗大神经的化学去细胞方法方面提供解剖学依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验设备 爱德华牌 TSJ-1A型自动组织脱水机(天津天利航空机电公司),BMJ-1型组织包埋机(天津天利航空机电公司),Leitz 1516型组织切片机(德国 Leica公司),BH-2 OLYMPUS生物显微镜(日本 OLYMPUS公司),实验所需猪、犬、大鼠由解放军总医院动物中心提供。

1.2 神经标本制备及分组 实验分 4组:Ⅰ组,新鲜人坐骨神经 5根；Ⅱ组,新鲜猪坐骨神经 5根；Ⅲ组,新鲜犬坐骨神经 5根；Ⅳ组,新鲜大鼠坐骨神经 5根。分别进行以下处理:无菌条件下取新鲜坐骨神经,显微镜下去除神经外膜上附着的脂肪组织,切取 5段长10 mm的神经段,采用 10%甲醛固定 24 h。神经固定后,流水冲洗 24 h。标本经 75%、85%、90%、95%乙醇及无水乙醇梯度脱水。标本在二甲苯溶液中进行透明处理。标本组织用石蜡包埋,横向切片,片厚 5.0 μm。切片用二甲苯、无水乙醇 95%、85%、75%乙醇梯度脱蜡。以 Harris苏木素液,盐酸乙醇、95%乙醇及酸化伊红乙醇液进行染色(HE染色)。以 95%乙醇、无水乙醇、二甲苯行脱水透明,中性树胶封固。显微镜下观察计量神经束膜厚度。Laminin免疫组化染色:横向切片,片厚 5.0μm。 3%H2O2孵育 5～10 min,消除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗,PBS液浸泡5 min。滴加 0.05%胰蛋白酶适量,置于 37℃恒温培养箱中消化 30 min,用于细胞内抗原的显示。10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育 10 min。倾去血清,滴加适量兔抗人层黏蛋白多克隆抗体工作液。37℃孵育 60 min。PBS冲洗 3次,每次 5 min。蒸馏水充分冲洗,复染、封片,显微镜下观察计量神经束膜内面积和神经面积。

1.3 分析方法 将所得切片照相,每张切片以 40倍连续拍照后使用 Photoshop图像处理软件将所得图片拼接,拼接为一张完整的神经横截面图,分别用不同颜色标注神经纤维和神经束,根据神经束标注颜色的像素求得神经束内截面积占神经截面积百分比。使用 BH-2 OLYMPUS生物显微镜自带测量软件测得神经束膜的厚度。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 17.0统计软件包进行 One Anova单因素方差分析(Tamhane法),数据以±s表示,以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

HE染色所得人坐骨神经横截面和神经束膜厚度见图 1、2。Laminin免疫组化染色所得人坐骨神经横截面见图 3。各组间坐骨神经结构参数比较见表1。由表1可见,不同种属间坐骨神经束膜厚度存在差异(F=7.48,P＜0.05),其中人坐骨神经的束膜厚度最厚,是猪的 2倍(P＜0.01),犬的 4倍(P＜0.01),大鼠的 9倍(P＜0.01)；猪坐骨神经束膜厚度是犬的 1.7倍(P=0.018),大鼠的 4倍(P=0.003)；犬坐骨神经束膜厚度是大鼠的 2.3倍(P=0.002)。不同种属间神经束内截面积占神经截面积百分比存在差异(F=8.10,P＜0.05),人与猪间比较无统计学差异(P=0.101),人与犬、大鼠间比较有统计学差异(P=0.02,P=0.005)。

表1 各组坐骨神经结构参数比较(±s)

表1 各组坐骨神经结构参数比较(±s)

组别 束膜厚度(μm)神经束内横截面积(×103像素)神经横截面积(×103像素)神经束内截面积占神经截面积(%)Ⅰ组 22.40±2.30 167.40±47.50 435.7±91.6 38.42±2.43Ⅱ组 9.40±1.67 72.82±0.02 229.0±27.4 31.80±4.02Ⅲ组 5.40±2.39 119.36±4.70 218.6±5.5 54.60±6.54Ⅳ组 2.34±0.42 63.80±5.70 89.6±10.6 71.20±9.24

3 讨论

周围神经缺损的修复是医学界尚未完全解决的难题之一。虽然目前公认自体神经移植效果最佳,但这种“拆东墙,补西墙”的办法有其局限性,且因供体有限,常无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要。医学界进行了各种替代材料修复周围神经缺损研究,未能取得令人满意的效果。大量周围神经损伤修复研究表明[3～5],异体神经具有来源广泛、保持神经天然结构等其他移植物所无法比拟的优越性。化学去细胞异体神经采用化学萃取法去除神经中的抗原成分(髓鞘、轴突),制备的化学去细胞异体神经具有免疫原性弱、细胞膜残片去除完全、神经基底膜管好等优点。我们自 1999年以来,开始了异体神经化学去细胞方面的研究,并在大小动物和初步临床应用方面取得系列成功[6～8]。

与大鼠比较,猪、灵长类和人等加大型哺乳动物神经明显增粗,结构也不尽相同。本研究通过体外实验对比发现,啮齿类小动物和大型哺乳动物坐骨神经之间的结构存在显著差异。就坐骨神经束膜而言,人的神经束膜厚度是猪的 2倍,犬的4倍,大鼠的 9倍。束膜作为一种结构致密的纤维结缔组织,是阻碍化学制剂进入神经束内的主要屏障,也是阻碍细胞残片去除移出神经组织的屏障。因此,研究不同动物的化学去细胞异体神经的结构是选择合适的萃取剂,确定合适的萃取浓度、萃取时间和萃取剂组合的一个基本点。萃取剂除了需要进入神经束外,还受到束膜间质的阻隔。因此粗大神经的去细胞效果不仅受到神经粗细的影响,还受到束膜间质和束膜厚度的影响。本研究表明,与人坐骨神经结构最接近的是猪的坐骨神经,在研究人的化学去细胞异体神经工艺时,可以以猪的坐骨神经为实验对象。

[1]王冠军,孙明学,卢世璧,等.改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2007,15(12):929-932.

[2]王鑫,王玉,彭江,等.粗大异体神经两种化学萃取方法的比较[J].中国矫形外科杂志,2010,18(9):1300-1302.

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[4]于海龙,彭江,孙华燕,等.化学去细胞同种异体神经复合缓释神经生长因子修复周围神经缺损[J].中国修复重建外科杂志,2006,20(8):779-782.

[5]Hudson TW,Liu SY,Schmidt CE.Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing[J].Tissue Eng,2004,10(9-10):1346-1358.

[6]孙明学,唐金树,许文静,等.化学去细胞同种异体神经移植的实验研究[J].中华骨科杂志,2006,26(4):267-271.

[7]孙明学,卢世璧,唐金树,等.化学去细胞异体神经修复神经缺损长度的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2006,14(8):603-607.

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