不同样品制备方法对RP-HPLC法测定附子生物碱含量的影响Δ

侯大斌，赵祥升

（西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳市 621010）

附子为毛茛科乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根，有效成分为乌头类生物碱：乌头碱（aconitine）、中乌头碱（mesaconitine）与次乌头碱（hypaconitine）等，是我国常用的中药和四川道地药材，具有抗炎、镇痛、强心、抗心律失常、降血糖、毒性等药理作用，有回阳救逆、补火助阳、散寒除湿的功效。近年来现代药理学研究证明，附子提取液还具有抗癌、抗衰老和增强免疫机能等作用[1～3]。附子中单一生物碱的检测最常用的是高效液相色谱（HPLC）法，并具有高温、高速、高灵敏度、高分辨度等优点，乌头碱类分子极性较强，比较适合用HPLC分析[4]。目前，附子中3种二萜生物碱HPLC法测定的样品制备方法比较多，本文主要比较不同附子样品制备方法的提取效果，选择合适的样品制备方法，优化3种生物碱的分离效果和出峰时间，为附子中3种生物碱含量的测定和附子质量控制提供科学的依据。

1 材料

1.1 仪器

1200LC-MS型液相色谱-质谱联用仪（包括紫外检测器，美国Varian公司）；紫外-可见近红外光谱仪（日本岛津公司）；旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；超纯水制造系统（上海优普实业有限公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈、乙二胺为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；乌头碱（批号：110797-200404）、新乌头碱（批号：110799-200404）、次乌头碱（批号：110798-200404）对照品（中国药品生物制品检定所）；试验材料为2007年12月在四川江油附子GAP基地收获的新鲜附子，经西南科技大学侯大斌教授鉴定为A.carmichaeli Debx.的子根。附子先用自来水清洗干净，再用蒸馏水漂洗2次，切成0.3 cm厚的片状，装入牛皮纸袋放入烘箱，在105℃烘30 min，在60～70℃下烘干至恒重，粉碎过60目筛，4℃冰箱保存，备用。

2 方法与结果

2.1 样品制备方法

方法1：按2005年版《中国药典》（一部）方法[1]操作。方法2：将附子药材粉碎，过60目筛，取药材粉末0.5 g，加浓氨试液2 mL润湿，加乙醚20 mL，超声处理50 min，过滤，用乙醚洗涤3次，每次10 mL，收集、合并所有滤液，于水浴上挥干溶剂，加入甲醇溶解残渣，过滤，定容至10 mL的容量瓶中，作为供试品溶液。方法3：精密称取样品0.5 g，滴加浓氨水2 mL浸润，再加入20 mL二氯甲烷，超声处理50 min，过滤，浓缩，用二氯甲烷定容至10 mL的容量瓶中。方法4：精密称取样品0.5 g，加95%乙醇50 mL，加热回流2 h，回收溶剂，残渣用20 mL、pH值2～3的盐酸溶液溶解，用10 mL氯仿萃取3次，除去氯仿层，用NaOH溶液调节水溶液的pH值为9～10，再用氯仿萃取3次，蒸干氯仿，用甲醇定容至10 mL的容量瓶中，作为供试品溶液。方法5：精密称取样品0.5 g，滴加浓氨水2 mL浸润，加入95%的乙醇20 mL，超声处理50 min，以下步骤与方法4相同。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，得各单一成分对照品贮备液；其它不同浓度的对照品溶液由贮备液稀释得到。

2.3 色谱条件

色谱柱：Zorbax extend-C18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相：乙腈-0.1%乙二胺（梯度洗脱：0→15→30→35→60种min，乙腈体积分数为35%→50%→75%→35%→35%）；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：240 nm。

2.4 试验条件的选择

2.4.1 检测波长的选择 已有文献报道，3种生物碱混合溶液的最大吸收波长有230、235、240 nm 3种[5～8]。将3种生物碱的3种溶液适量混合后检测，最大的吸收波长为240 nm。同时，在此波长下峰面积最大，达到基线分离，基线也更稳定，故确定检测波长为240 nm。

2.4.2 流动相的选择 新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的极性由强到弱。在RP-HPLC中，由于醇-水系统热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时，易导致基线漂移[9]，同时甲醇的洗脱能力不强。因此，在试验中选择了洗脱能力较强的乙腈作为流动相。流动相中加入乙二胺可以防止分离过程出现拖尾现象，达到改善色谱峰形和提高分离度的目的。比较不同配比乙腈-0.1%乙二胺溶液对新乌头碱、乌头碱、次乌头碱保留时间、分离度及峰形的影响，当乙腈的比例过大时，出峰虽然早，但是3个峰的分离效果不好。最后确定流动相为上述色谱条件时，3种生物碱的分离效果最优。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；a.新乌头碱；b.乌头碱；c.次乌头碱Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；a.mesaconitine；b.aconitine；c.hypaconitine

2.5 线性关系的考察

准确吸取新乌头碱、乌头碱、次乌头碱贮备液适量，分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，振荡均匀，作为对照品稀释液。在同一色谱条件下分别进量20 μL，确定标准物质的保留时间。然后各取一定体积的贮备液配成不同浓度的混合对照品溶液，分别平行测定3次（均进样20 μL），以平均峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归。各物质的回归方程、相关系数和线性范围见表1。

表1 3种生物碱的回归方程、相关系数和线性范围Tab 1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of 3 kinds of alkaloids

2.6 不同样品制备方法的生物碱含量测定

在上述色谱条件下，取不同方法制备处理的供试品溶液适量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取20 μL为进样量，分别平行进样3次，以平均峰面积按回归方程计算浓度。不同处理方法测得3种生物碱的含量见表2。结果，“方法2”的提取率最高，3种生物碱的含量在各处理方法中均是最高。

表2 不同处理方法的生物碱含量（n＝3）Tab 2 Content of alkaloids prepared by different sample preparations（n＝3）

2.7 精密度试验

精密吸取“方法2”的供试品溶液20 μL，重复进样5次，进行测定。结果，新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积RSD分别为1.04%、1.47%、1.01%，表明方法的精密度良好。

2.8 稳定性试验

对“方法2”供试品溶液在8 h之内每隔1 h进行1次考察。结果，新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为1.60%、1.72%、1.23%（n＝9），表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.9 重复性试验

精密称量干燥附子粉末0.5 g共5份，按照“方法2”制备后进行测定。结果，新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为1.35%、2.07%、1.29%，表明方法的重复性较好。

2.10 加样回收率试验

精密称量干燥附子粉末0.5 g共5份，每份分别加入各对照品贮备液，使新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的加入量分别为450、200、400 μg。按“2.1”项下方法制备供试品溶液后进行测定，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝5）Tab 3 Results of recovery test（n＝5）

2.11 含量测定

取干燥的附子粉末0.5 g，按照“2.1”项下“方法2”制备样品，在上述色谱条件下测定附子中3种生物碱的含量。结果，附子中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的含量分别为1.34、0.383、1.33 mg·g-1（n＝3）。

3 讨论

HPLC法测定附子中生物碱的含量的样品制备方法主要是超声和加热回流2种。加热回流往往时间长、步骤较多，过程中流失的生物碱较多，“2.1”项下“方法4”和“方法5”就是因为步骤繁多，因此测得含量较低，在HPLC法测定生物碱含量的样品制备中应该尽量减少操作的步骤。药典法的测试样品用量大、时间长，主要是以测乌头碱的含量为主，不是对3种组分同时测定。3种生物碱都是碱性成分，药材粉末的碱化程度会影响到提取率，本试验用氨水湿润，再加入不同的提取试剂，超声使药材分散，易于溶剂渗透，使提取效率提高。超声时间影响到脂溶性生物碱的提取效率，本试验比较了在同一频率及温度条件下的超声时间，发现在50 min时的提取率最高，时间加长后提取率差异不大，因此本试验选择50 min为超声时间。

对照品的溶解在以前人们用的主要是非惰性有机溶剂甲醇、乙醇，但是在试验中发现对照品的混合液放置12 h后，在主峰的附近会出现杂峰，说明生物碱在这些溶剂中可能发生醇解反应。因此，本试验改为乙腈溶解对照品。

本试验的样品处理用乙醚超声法提取，新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的分离效果较好、出峰时间短、回收率较高、操作简便，是附子3种生物碱含量测定中样品制备的首选方法。该方法可为附子中3种生物碱的含量测定和成分研究提供科学的依据。

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