马来酸咪达唑仑片在汉族健康人体内的药动学研究Δ

郭涛，毛桂福，夏东亚，颜鸣，唐云彪（.沈阳军区总医院药剂科，沈阳市 006；.沈阳药科大学药学院，沈阳市 006）

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱系统，包括600型四元泵、2487紫外检测器（美国Waters公司）；AUW120D电子分析天平（日本岛津公司）；PB-10 Sartorius普及型pH计（德国赛多利斯公司）；YKH-Ⅱ型液体快速混合器（江西医疗仪器厂）；KQ3200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-5台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；L2199氮吹仪（北京来亨科学仪器公司）。

1.2 试药

马来酸咪达唑仑片（江苏恩华药业股份有限公司，规格：每片15 mg，批号：06052401）；马来酸咪达唑仑标准品（中国药品生物制品检定所，批号：171250-200401，含量：100.0%）；内标：三唑仑标准品（中国药品生物制品检定所，批号：171250-200602，含量：100.0%）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余均为国产分析纯，水为双重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 受试者选择

选择汉族健康受试者10名，男、女各半，年龄（23±2）岁，体质量（62.4±6.4）kg，身高（167±9）cm，体质量指数（BMI）（22.5±2.3）kg·m－2。其父母、祖父母、外祖父母均为汉族婚配；试验前进行病史询问和体格检查，血常规、肝功、肾功等均正常；无药物过敏史及药物依赖史，无精神病史，不嗜烟、酒；试验前15天未服用任何药物；试验期间禁烟、酒及含咖啡因的饮料。受试者在试验前了解试验目的、方法、意义以及可能发生的不良反应，并签署知情同意书。

2.2 给药方法

受试者试验前1天进食清淡晚餐后禁食12 h，试验日晨空腹口服咪达唑仑片15 mg，用温开水200 mL送服。服药2 h后方可饮水，服药4、10 h后进食统一标准餐。试验期间避免剧烈活动。试验方案经沈阳军区总医院医学伦理委员会批准。

2.3 血样采集

于服药前0 h和服药后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、9、12 h时分别由受试者前臂静脉取血液5 mL，置肝素抗凝管中并摇匀，离心分离血浆，于－25℃冷冻保存。

2.4 血浆样品处理

取血浆1.0 mL，加入内标溶液（40 ng·mL－1三唑仑溶液）50 μL和磷酸氢二钾缓冲溶液0.2 mL，混匀后加入环己烷-三氯甲烷（4∶1）混合液4.0 mL，涡旋振荡2 min，4000 r·min－1离心10 min，取上层有机相置5 mL离心管中，于55℃条件下用空气吹干，残渣加甲醇-10 mmol·L－1盐酸（45∶55）混合溶剂80 μL 和正己烷50 μL，涡旋振荡1 min，2500 r·min－1离心1 min，弃去上层有机相，取下层溶液20 μL进样。

2.5 色谱条件

色谱柱：Diamosil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-10 mmol·L－1醋酸铵溶液（pH 3.95）（50.2∶8∶41.8）；流速：1.1 mL·min－1；检测波长：220 nm；柱温：室温；灵敏度为0.5AUFS。在该色谱条件下，混合空白血浆、混合空白血浆加马来酸咪达唑仑对照品与内标、血浆样品加内标分析结果表明，咪达唑仑与内标峰形良好，血浆内源性杂质、代谢物等不干扰样品测定。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+马来酸咪达唑仑对照品+内标；C.受试者的血浆样品+内标；1.三唑仑；2.咪达唑仑Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma spiked with midazolam and IS；C.plasma sample spiked with IS；1.triazolam；2.midazolam

2.6 标准曲线的制备

精密量取系列浓度的对照品溶液各50 μL至8支具塞玻璃试管中，再加入空白血浆1 mL，使咪达唑仑血浆浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 ng·mL－1，按“2.4”项下方法操作，进样测定，记录色谱。以血浆样品中待测物浓度（X）为横坐标，待测物与内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权（W＝1/C2）最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程：Y＝0.037X－0.010（r＝0.9980）。结果表明，咪达唑仑血药浓度在2.5～320.0 ng·mL－1范围内线性关系良好。咪达唑仑血浆的最低定量浓度为2.5 ng·mL－1。

2.7 方法回收率

取空白血浆1 mL，加入适量对照品溶液，制备低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3种浓度的质控样品，按“2.4”项下方法操作，每一浓度测定5个样本，计算方法回收率，结果见表1。

表1 方法回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Recovery test results（n＝5）

2.8 提取回收率和精密度

取空白血浆1 mL，加入适量对照品溶液制备低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3 种浓度的质控样品，按“2.4”项下方法操作，每一浓度测定5个样本，计算方法的日内精密度，低、中、高3种浓度的日内RSD分别为15.5%、8.0%和4.9%。连续测定5 d，计算方法的日间精密度，低、中、高3种浓度的日间RSD分别为18.3%、10.2%和3.2%。另将测得的质控血浆样品的峰面积与相同浓度对照品溶液直接进样测得的色谱峰面积之比，计算提取回收率，结果低、中、高3种浓度的提取回收率分别为80.5%、80.0%、84.4%。

2.9 样品稳定性考察

取空白血浆1 mL，制备低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3种浓度的血浆样品，分别在室温、－25℃冰冻和冻融条件下存放。结果表明，咪达唑仑的血浆样品在室温放置8 h、－25℃冰冻14 d和反复冻融3次的条件下都是稳定的。

2.10 药-时曲线

10名受试者口服咪达唑仑片15 mg后，测得的平均药-时曲线见图2。

图2 受试者单剂量口服咪达唑仑片15 mg后的平均药-时曲线Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of midazolam after administration of a single oral dose of 15 mg midazolam tablets in 10 healthy volunteers

2.11 药动学参数

采用孙瑞元等编写的DAS 2.0药动学软件对药-时数据进行拟合，以非室模型估算药动学参数，采用梯形法计算AUC0～12，Cmax与tmax为实测值的平均数，结果详见表2。

表2 受试者单剂量口服咪达唑仑片15 mg后的药动学参数Tab 2 The pharmacokinetic parameters of midazolam after administration of a single oral dose of 15 mg midazolam tablets in 10 healthy volunteers

2.12 安全性评价

在整个试验过程中，10名健康汉族受试者均未发生明显不良反应，表明受试者对单剂量口服咪达唑仑片有较好的耐受性。

3 讨论

本文建立的HPLC法，以甲醇、乙腈和10 mmol·L－1醋酸铵溶液组成三元流动相，能消除代谢物与内源性杂质对咪达唑仑和内标的干扰，使最低定量浓度达到2.5 ng·mL－1，且各项指标符合临床药动学研究的要求。

服药30～60 min后，有9名受试者陆续入睡，2～4 h后陆续醒来，多数受试者不能回忆睡眠期间血样采集的事情，这与咪达唑仑的作用特点相符。但1名女性受试者在整个试验过程中未入睡，测定其血药浓度后，发现有吸收滞后现象，且其浓度普遍较低。

汉族健康受试者单次口服15 mg咪达唑仑片剂后，tmax、t1/2分别与国内文献[1，3]报道相似。Cmax、AUC0～12分别与文献[1]报道的（220.57±67.64）ng·mL－1和（587.86±161.65）ng·h·mL－1有较大差异，与文献[3]报道的67.2～154.0 ng·mL－1及128～382 ng·h·mL－1相近。从表2看，各项药动学参数都存在较大的个体差异，由于咪达唑仑的吸收和代谢过程都受到肠道、肝脏细胞色素P450（CYP）3A酶的催化代谢作用[5]，而遗传、环境、生理等多种因素导致CYP3A酶活性可相差50倍[6]，因而导致了咪达唑仑药动学过程的个体差异，临床应用时应该注意个体化给药。

7位受试者的药-时曲线图有双峰现象，第1个峰出现在给药后0.33～1 h，第2个峰出现在给药后2～3 h。产生双峰现象的机制主要与其松弛胃肠平滑肌，影响胃的排空有关[7，8]。国内未见有关咪达唑仑片剂双峰吸收现象的报道。

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