葛根素对血管平滑肌细胞迁移的影响

柴欣楼 王 伟 王绿娅 张永生

(1北京中医药大学，北京市朝阳区北三环东路 11号，100029;2北京市安贞医院)

冠脉形成术造成了血管内皮细胞损伤，加速了血栓的形成。附壁血栓的形成，不仅造成血管的急性闭塞，而且为平滑肌细胞 (vessel smooth musle cell，VSMC)的内迁提供了框架，增殖的 VSMC由血管中层向内膜的迁移是内膜增厚的一个重要机制。在此过程中，细胞边缘存在大量基质金属蛋白酶(maxtrix metalloproteinases，MMPs)和纤维蛋白溶解酶，这 2种物质可降解细胞外基质，加速 VSMC的迁移[1]。VSMC迁移的结果可导致内膜中 VSMC的大量积聚和结缔组织的形成，进而促进新生内膜形成。

葛根素(Pur)为异黄酮类化合物，属于植物雌激素。现代药理研究证明 Pur在心血管中具有多种功能，可扩张心、脑血管，降低血黏度，抑制血小板活性，降低血小板黏附率;可对抗 H2O2引起的无血清培养的 VSMC凋亡及坏死[2]。

本研究以葛根素为研究对象，构建 VSMC迁移模型，Boyden小室法检测 VSMC的迁移，ELISA法检测MMP-2、MMP-9的含量，在此基础上采用明胶—聚丙烯酰胺电泳酶谱分析 VSMC分泌 MMP-2的活性。

1 材料与方法

1.1 材料与分组 1)主要试剂:DMEM培养液(美国GIBCO公司产品)，胎牛血清 (FBS，Hyclone公司产品)，凝血酶(冻干粉，美国 Sigma公司产品)，葛根素原粉(纯度 99.7%，由卫生部药品生物制品鉴定所提供)，MTT、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶和 EDTA、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉生物制品有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(美国 Bio-Rad公司)，MMP-2、MMP-9 ELISA试剂盒(鼎国试剂公司)。2)VSMC体外培养及鉴定:常规组织贴块法培养VSMC。实验用 4～8代细胞。用光镜和免疫组化方法进行鉴定。3)药物配制及梯度稀释。4)葛根素原粉，选择二甲基亚砜为溶剂，配制浓度分别为 10mM和1mM。将 1mM药物溶液用溶剂以 1:10的比例进行梯度稀释，使最终药物浓度从 1mM变化到 1nM。5)分组。正常对照组:用含 1%小牛血清 DMEM培养液培养细胞。模型组:加终浓度为 5u/L凝血酶的 1%小牛血清 DMEM培养液培养细胞。葛根素组:加终浓度为5u/L凝血酶和浓度为 10-2mol◦L-1的葛根素溶液的1%小牛血清 DMEM培养液培养细胞。雷帕霉素组:加终浓度为 5u/L凝血酶和浓度为 10-4mol◦L-1的雷帕霉素溶液的 1%小牛血清 DMEM培养液培养细胞。

1.2 实验方法 血管平滑肌细胞培养:1)空气栓塞法处死新西兰大耳白兔，无菌条件下分离全段胸主动脉，立即置于含青霉素 100u/mL，链霉素 100mg/mL的无菌生理盐水中。2)超净工作台上，用含青霉素、链霉素的生理盐水反复冲洗，去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞，然后将一次取材的 2～3条血管中膜组织混合在一起，置于无菌培养皿中。3)滴加少许培养液使组织保持湿润，用眼科弯剪反复剪切成 1mm×1mm大小的组织块。剪切好的组织小块均匀置于瓶底，组织块间距 0.5cm。盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上并向瓶内注入含20%胎牛血清的 DMEM培养液，于 37℃孵箱内放置。4)经 2～4h孵育后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置培养 3～5d。待有细胞从组织块周围游出后换液。5)当细胞长成“峰”“谷”交错的致密细胞层，即可进行传代。

1.3 Boyden小室法检测 VSMC的迁移

1.3.1 VSMC细胞，0.125%胰酶消化后离心 1000r/min×5min，PBS液洗涤 2次，离心，弃上清。

1.3.2 用含 10%CFBS的 DMEM培养液配成细胞密度 1×106个/L左右细胞悬液，使细胞在培养液中悬浮 1h恢复形态。混匀细胞悬液，吸取 0.35mL加入Boyden小室的上室内。

1.3.3 下室加入 2%CFBS的 DMEM培养液作为正常对照组，其余加入待测药品等，封闭下室小孔，置37℃，5%CO2孵箱内培养 6h。

1.3.4 取出 Boyden小室内的微孔滤膜，PBS洗 2次，冷丙酮固定 10s，PBS洗 2次。

1.3.5 以苏木素染色 5min，蒸馏水冲洗，1%盐酸乙醇脱色 3min，流水冲洗，1%NaHCO3显蓝染色 3min。

1.3.6 水洗后，37℃过夜，系列梯度乙醇脱水:70%-75%-80%-90%-100%各 0.5min。

1.3.7 二甲苯透明。

1.3.8 以中性树胶封片。设 5个重复孔。

1.3.9 在显微镜下，随机计数 10高倍视野下移出滤膜的 VSMC数，每张膜观察 2遍，计算其平均数。5份滤膜内的移动细胞平均数表示 VSMC的迁移数量。

1.4 ELISA法检测 MMP-2、MMP-9的含量

1.4.1 VSMC细胞，0.125%胰酶消化后离心 1000r/min×5min，PBS液洗涤 2次，离心，弃上清。

1.4.2 用含 10%CFBS的 DMEM培养液配成细胞密度 1×106个/L左右细胞悬液，6孔培养板，加入细胞悬液 1000μL继续培养 48h后，去培养液。

1.4.3 加入无血清培养基培养 24h后，弃上清。加入待测药品等，继续培养 24h。

1.4.4 将上述细胞收集，低速离心，保留上清。加入96孔培养板，100μL/孔，设 5个重复孔。

1.4.5 建立标准曲线。酶标仪检测吸光度值(490nm)。

1.5 明胶—聚丙烯酰胺电泳酶谱分析 VSMC分泌MMP-2的活性

VSMC细胞，0.125%胰酶消化后离心 1000r/min×5min，PBS液洗涤 2次，离心，弃上清。

1.5.1 用含 10%CFBS的 DMEM培养液配成细胞密度 1×106个/L左右细胞悬液，6孔培养板，加入细胞悬液 1000μL继续培养 48h后，去培养液。

1.5.2 加入无血清培养基培养 24h后，弃上清。加入待测药品等，继续培养 24h。

1.5.3 将上述细胞收集，低速离心，保留上清。

1.5.4 Bradford法测培养液蛋白浓度，牛血清白蛋白作标准。

1.5.5 按常规方法灌制 10%分离胶和 5%浓缩胶，但分离胶中含 0.1%明胶作为底物。取 10μL上清液样本与等体积的上样缓冲液混合，室温放置 30min，上样，电流 15mA电泳约 90min，溴酚蓝到达两层胶的分界处，将电流调至 20A，电泳 90min后溴酚蓝到达底线，停止电泳。

1.5.6 小心将胶剥离，经 2.5%TritonX-100漂洗1h，加入反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCL，10mmol/L CaCl2，20mmol/LNaCl)37℃过夜。

1.5.7 次日，0.5%考马斯亮兰染色 4h，脱色至蓝色背景下白色条带清晰可见。将凝胶扫描成像。

实验重复 3次，以空白对照的条带的灰度值为 1，实验数据与空白对照相比取值。

1.6 统计学方法 所有数据由 SPSS统计软件进行单因素方差分析，以 ¯x±s表示，P＜0.05认为有统计意义。

2 实验结果

2.1 VSMC细胞的鉴定结果 倒置相差显微镜观察细胞生长形态及生长规律。VSMC呈长梭形、三角形或星形等。细胞突起较长，相互接触，对数生长期细胞呈典型“峰与谷”样生长。核较大，原形或卵原形，胞浆丰富。密度大时可重叠生长。

2.2 葛根素对 VSMC的迁移的影响(¯x±s，n=6)葛根素组与模型组相比，P＜0.01。

2.3 葛根素对 VSMC分泌的 MMP-2、MMP-9含量的影响 (¯x±s，n=6) VSMC分泌的 MMP-2、MMP-9含量。葛根素高浓度组与模型组相比，P＜0.01;葛根素低浓度组与模型组相比，P＜0.05。

2.4 葛根素对 VSMC分泌的 MMP-2活性的影响实验原理:实验以明胶为底物，明胶被考马斯亮蓝染为蓝色背景，若样本中含有可以分解明胶的 MMP-2则在相应分子量处可出现底物被水解的透明条带，且根据条带的灰度值可以反映酶活性的大小。若以不同的胶原或酪蛋白为底物，可以测出不同种类 MMPs的活性。

表1 VSMC分泌的 MMP-2灰度值

3 讨论

早期血管弹性回缩，晚期血管重塑和新内膜增生是直接导致 PTCA术后再狭窄的三个主要原因[3]。植入支架虽可扩大管径，防止弹性回缩发生，但支架本身对新生内膜的形成无任何抑制作用，而且它作为异物停留在体内可能导致血栓形成并刺激 VSMC增生和新生内膜肥厚，最终导致支架内再狭窄的发生[4]。

VSMC是血管壁的主要细胞成分之一，是决定血管顺应性和血管重构的重要因素，血管壁增厚和顺应性下降主要源于 VSMC的肥大、增生，产生和分泌细胞外基质增加等[5]。内膜损伤后内皮细胞释放的血管活性物质和生长因子与 VSMC膜受体结合后使癌基因激活、转录、表达异常，VSMC由收缩表型转化为合成表型，从细胞周期 G0期脱逸出并进入细胞增殖周期，发生分裂增殖并分泌大量的细胞外基质[6]。因此，在新生内膜形成过程中，VSMC移行、增殖和分泌是血管内膜增生的三个重要步骤[7]。

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要包括胶原、糖蛋白、葡萄糖氨基糖苷和蛋白聚糖四类。在正常组织，这些大分子存在于内膜、中膜、外膜，起保持血管弹性和完整性的作用。研究表明成熟的 VSMC没有迁移的特性，而且当其处于 S或 G2/M期时不能迁移，而只有在 G1向 G1/S转化过程中才可能迁移[8-9]。中膜 VSMC的迁移除与细胞本身有关外，还须突破细胞周围的迁移屏障即成分复杂的 ECM，因此在损伤早期 ECM降解，对促进 VSMC迁移有重要作用，晚期ECM沉积对血管重塑起重要作用。MMPs主要降解ECM[10]，在正常的血管中内皮细胞和 VSMC经常产生MMP-2，TIMP-1和 TIMP-2，成为血管组织细胞更新必不可少的条件。根据降解的对象不同，将 MMPs分为 4类:MMP-1(胶原酶)、MMP-2(明胶酶 A)、MMP-3(基质裂解素 1)、MMP-9(明胶酶 B)、MMP-12(金属蛋白弹性酶)，膜型金属蛋白酶。当白介素1、肿瘤坏死因子、γ干扰素、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞化学趋化蛋白Ⅰ等炎症细胞因子浓度升高时，促进 VSMC、内皮细胞和泡沫细胞表达 MMPs。这可降解 ECM，促进淋巴细胞和巨噬细胞迁移到内皮下;促进 VSMC由中膜迁移到内膜。故研究细胞外基质的降解，对于 VSMC的迁移有重要意义[11]。本实验建立了细胞迁移模型，并在此基础上观察了 MMP-2和 MMP-9，结果发现葛根素可抑制 VSMC的迁移，同时，抑制 MMP-2、MMP-9，在此基础上继续观察了葛根素对 VSMC分泌的 MMP-2活性的影响，发现葛根素组与模型组相比可显著抑制 MMP-2的表达(P＜0.05)。关于葛根素抑制 VSMC迁移，通过本实验的研究可以发现，葛根素抑制了 VSMC的增殖，使处于G1期的细胞较多，增加了其迁移到内膜下组织的机会，因而抑制其迁移过程变得尤为重要。但细胞迁移受多种因素影响，不仅仅与 MMP-2、MMP-9有关。这也成为今后研究关注的焦点问题。

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