术中放疗对保乳患者伤口引流液内 GRO-1、VEGF的影响

刘小健 周士福 周洪伟 时伟峰 戴启明 孙春雷 孟 东

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,保乳手术已成为欧美国家治疗早期乳腺癌的主要方法之一 ,术后全乳放射治疗是目前早期乳腺癌保乳手术的标准治疗[1,2],但是Vicini等研究结果表明保乳患者术后全乳照射不一定是必要的,采用电子射线的术中放疗(21 Gy)原则上可以替代保乳术后的外部放疗。同时 Barbara等[3]研究表明,保乳患者术中放疗后 24 h内伤口引流液作为乳腺癌细胞生长的 1个微环境,对乳腺癌细胞的增殖、生长、运动有着一定的影响。本课题即对引流液内的生长相关性癌基因(growth-regulated oncogene-1,GRO-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量的变化做一研究,并分析两者的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2007年 6月至 2009年 9月我院乳腺中心收治的60例乳腺癌保乳手术患者,均为女性,年龄 35～50岁,平均 42.60岁,将 60例保乳患者随机分为两组,每组 30例。其中一组为对照组:单纯行保乳手术;另一组为试验组:行保乳手术并辅以术中电子射线照射。试验组患者具体操作过程如下:所有行术中电子射线患者采用硬膜外连续麻醉,以便患者配合,同时照射过程中麻醉医生通过加速器室内摄像系统监察患者。直线加速器室术前 1天用紫外线照射灭菌。手术者在专用手术室内将圆形铅板置乳房后间隙,丝线缝合乳腺,再进一步游离乳腺浅面以便限光筒的放入,准备工作完善后,将患者及麻醉监护装置推至隔壁加速器室,使用 Varian Clinic 23EX直线加速器,根据肿瘤大小及部位选择平面或斜面相应直径的限光筒(均为无菌状态),应用限光筒后,加速器的电子线百分度剂量(percent depth dose,PDD)会有变化,根据我院实际测量的数据,为保证靶区乳腺表面达到 90%以上的处方剂量,我们应用 2～5mm的生理盐水纱布作为组织等效填充物,放置在照射的乳腺表面。通过皮肤切口置入限光筒,皮肤及皮下脂肪位于限光筒外,在加速器工作人员的配合下固定限光筒装置后,选择 9Mev电子线,靶区处方剂量为 21 Gy,单次照射,时间约为 2～3 min。

1.2 标本采集

所有保乳患者切口处均放置潘氏引流管以方便引流液采集。待术后24 h用 20ml无菌针筒从潘氏引流管内抽取引流液,然后将引流液放置苏州大学附属第四医院中心实验室无菌离心管内,离心机 2 000转/分,离心 10 min后取上清液,并将上清液存放至-70℃冰箱中,待实验前半小时取出恢复至常温。

1.3 试剂与仪器

人 GRO-1和人 VEGF的 ELISA试剂盒购自美国ADL公司,酶标仪由苏州大学附属第四医院检验科提供检测。

1.4 方法和步骤

操作方法及步骤严格按照人 GRO-1和人 VEGF试剂盒产品说明书进行。经过标准品的稀释与加样、温育、配液、洗涤、加酶、2次温育及洗涤、显色等一系列步骤后,在 450 nm波长下依次测定各孔的吸光度(OD值)。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 GRO-1标准品曲线拟合图及拟合方程

拟合方程:y=a+bx2+cx3+dx4+ex5(a=0.37123274,b=-054.453956,c=1942.2459,d=-4465.7715,e=3088.8425)

GRO-1标准品曲线拟合图见图 1。

图1 GRO-1标准品曲线拟合图

根据上述曲线方程计算出两组患者 24 h伤口引流液内 GRO-1含量,对照组和试验组GRO-1含量分别为(50.08±14.09)pmol/l和 (15.64±2.80)pmol/l,两者比较有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 VEGF标准品曲线拟合图及拟合方程

拟合方程:y=a/(1+be-cx)(a=1850.0786,b=20.691958,c=6.9705137)

VEGF标准品曲线拟合图见图 2。

图2 VEGF标准品曲线拟合图

根据上述曲线方程计算出两组患者 24 h伤口引流液内 VEGF的含量分别为(427.16±20.18)ng/l和(206.55±6.34)ng/l,两者比较有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 GRO-1表达与 VEGF表达的关系

对照组患者引流液内 GRO-1和 VEGF的含量分别为(50.08±14.09)pmol/l和(427.16±20.18)ng/l,两者表达呈正相关性(γ=0.817,P＜0.01);试验组患者引流液内 GRO-1和 VEGF的含量分别为(15.64±2.80)pmol/l和(206.55±6.34)ng/l,两者表达也呈正相关性(γ=0.449,P＜0.05)。

3 讨论

Paget等[4,5]首次提出了“种子和土壤”理论假设,“种子”我们可以认为就是术后瘤床内的残瘤细胞,“土壤”即为术后的瘤床。目前保乳手术术后的复发灶大部分局限在手术切口瘢痕处,这一现象最常见的解释是切口内残余肿瘤细胞的存在[3],也即所谓“种子”的残留,但是其中微环境成分的作用也是 1个不容忽视的因素。从哲学的角度来看,“种子”的存在可以认为是乳腺癌局部复发这一事件的内因,而“土壤”——“瘤床”内成分的改变即为外因,内因和外因共同作用加速事件的发生、发展。但是我们可以干扰其中的外因以此来抑制保乳手术患者局部复发这一事件的发展——ELIOT。

从国外的数据来看,2001年伦敦大学医学院 25名接受术中放疗患者的随访结果(中位随访 2年)表明,该组患者无明显并发症及无局部复发[6],2008年意大利米兰欧洲肿瘤研究所公布了其 1999年 7月至2006年 12月经术中放疗治疗的 1246例(未进入随机试验)原发性乳腺肿瘤患者研究结果[7],随访 0.3～94.7个月(中位随访 26个月),24例(1.9%)局部复发,与常规全乳放疗局部复发率相近,不高于常规全乳放疗患者。这些研究结果表明了经过术中放疗后,保乳患者局部的复发率控制效果取得了标准化术后全乳放射治疗一样的效果。

所以我们通过本次实验,对其中微环境内成分的变化做一研究,以期望提供 1个新的理论依据来解释为何也能起到和全乳放射治疗一样的局部复发控制效果。从实验的结果来看,行 ELIOT的保乳患者“土壤”内的 GRO-1和 VEGF这两者的含量发生了明显的改变,其中可能的机制有:一是手术本来切除了肿瘤从而减少了肿瘤对 GRO-1和 VEGF的分泌;二是经过术中电子射线照射,破坏了 GRO-1和 VEGF的蛋白结构;从而减少了渗液内 GRO-1和 VEGF的含量,而 GRO-1和 VEGF这两者与肿瘤的生长、远处转移、复发等有着密切联系的。

GRO-1也称 GRO-α,系统命名为 CXCL1,过去曾被称为 MGSA(melanomagrowth stimulatory activity),对应于小鼠为 KC或 MIP-2(macrophage inflame matory protein一 2)基因。GRO家族是一类属于 ELR-CXC族的趋化因子,除了 GRO-α外,还包括 GRO-β,GRO-γ(即 GRO-1,GRO-2,GRO– 3),GRO-α,GRO-β,GRO-γ相互比邻,紧密连锁。GRO家族在恶性肿瘤演进中的作用越来越受到重视。Folkman的研究表明肿瘤是典型的血管依赖性病变,缺乏血管形成时肿瘤生长受限[8]。而 GRO-1作为 GRO家族中重要的一员,除了能自分泌作用促进细胞生长除了能自分泌作用促进细胞生长,还能通过旁分泌作用促进肿瘤中新生血管的生长和转移[9],同时 GRO-1还有促进肿瘤细胞增殖作用[10]、促进肿瘤细胞侵袭转移作用[11]。

VEGF是肿瘤内血管生长的促进因子,它们过表达与肿瘤的发生、转移及治疗密切相关,是近年来发现的 1种内皮细胞分裂素,也是 1种糖蛋白,VEGF是以同源聚体的方式存在,其分子量为 34～45 kD。VEGF能够特异性地与内皮细胞表面的Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt1和 KDR/Flk1结合,促进内皮细胞分裂、增殖并增加血管通透性,并上调 Bcl-2基因表达从而抑制肿瘤细胞凋亡,间接促进肿瘤细胞增殖和生长。因此,VEGF高表达对癌细胞生长、转移有明显的促进作用[12]。

在本次试验中我们发现,经过过术中放疗后的伤口引流夜内的 GRO-1含量与 VEGF的含量明显低于术后放疗组内的含量,因此,我们可以认为,经过术中放疗以后的保乳患者瘤床内的成分发生了相应的改变,即所谓的“土壤”发生了一定的改变,而“土壤”内GRO-1含量的降低可以减慢肿瘤细胞的新生血管的形成、阻碍肿瘤细胞的增殖作用及侵袭转移作用,VEGF含量的减少可以相应减弱 Bcl-2基因的表达,阻止肿瘤细胞增殖、生长及转移作用。从对照组上看,GRO-1和 VEGF在表达上均呈正相关性,其中比较重要的原因是 GRO-1在肿瘤发生中的新生的形成呈剂量关系,并且在肿瘤发展中可以通过增强 VEGF促进血管化作用[13]。而通过术中电子射线照射后,GRO-1量的减少对肿瘤血管形成及转移促进作用也相应减轻,从而进一步可以减轻 VEGF促进血管化的作用,使得原来有助于肿瘤在局部形成的“土壤”变成 1个不利用“种子”复发的微环境。同时 GRO-1和 VEGF在这一微环境内的表达量均有所明显下降,并且两者之间的表达也呈相关性,一方的减少也引起了另一方的减少,两者同时的表达下调使得在减少肿瘤转移、复发有了一定协同作用,这也许可能成为解释局部复发率下降的 1个很重要的原因,并且也在一定程度上支持了在保乳手术中术中放疗这一技术的可行性,而这对于广大乳腺癌患者来说毫无疑问是 1个福音,同时术中放疗既可以减少对皮肤、皮下组织及对侧胸壁和肺的射线损伤,避免了大多数患者不宜接受长期术后放疗,缩短了患者住院时间及术后放疗剂量,减少了放疗的费用。

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