FTY720抑制裸鼠人肝癌细胞系 MHCC-97H移植瘤生长的实验研究

肖江卫 王崇树 魏寿江 王 城 周 彤 李劲东 彭 勇

芬戈莫德(FTY720)是 1种小分子的免疫调节剂,它是从冬虫夏草中分离出来的活性成分 ISP-1,经过化学改造而得来[1]。目前已临床应用于抑制实体器官的移植免疫排斥。最近的实验研究发现,FTY720还具有多种肿瘤抑制效应,如抑制乳腺癌的生长和转移[2]、抑制前列腺癌的侵袭[3]和诱导人膀胱癌的凋亡[4]等。但国内外 FTY720对肝癌细胞的抑制效应尚研究不多,而且机理未明。本实验通过 FTY720对裸鼠肝移植瘤的抑制作用进行研究,并进一步阐明其分子机制,从而为临床治疗肝癌提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和试剂 选取健康、雄性、体重 20 g的 SPF级裸鼠 32只,裸鼠由香港大学实验动物中心提供。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Caspase 3以及 Phospho-Akt(Ser473)单克隆抗体(均购自美国 eBioscience公司)、原位细胞 TUNEL检测试剂盒(购自瑞士 Roche公司)等。

1.1.2 实验分组 将种植肿瘤 1周后的荷瘤裸鼠随机分入 3组,每组各 10只。3个组分别为:生理盐水对照组、FTY720治疗组 (5mg/kg)、FTY720治疗组(10mg/kg)。

1.2 实验方法

1.2.1 裸鼠肝脏移植瘤的制备[5]将体外培养的MHCC-97H(metastatic human hepatocellular carcinoma 97H)细胞系 1×107注射于裸鼠皮下,待肿瘤生长至1.0 cm左右,在无菌含 DMEM培养皿中将肿瘤切至0.1cm左右大小均匀的瘤块,然后将瘤块种植入裸鼠的左肝外叶,植入肿瘤后 1周的裸鼠再进行药物治疗。

1.2.2 常规组织病理学及免疫组织化学检查 常规苏木精-伊红染色(HE staining),显微镜下观察肿瘤的组织形态学改变;采用免疫组织化学方法,检测增殖细胞核抗原 (PCNA)、Caspase 3、Phospho-Akt(Ser473)表达水平变化。随机选取 3个高倍镜视野(400×)计数阳性细胞占总肿瘤细胞的百分比,并比较各组阳性细胞百分比的差异。

1.2.3 TUNEL法检测移植瘤凋亡水平变化 通过原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)检测移植瘤凋亡水平变化。结果判定:阳性反应为胞核有棕黄色颗粒沉积,并随机选取 3个高倍镜视野(400×)计数凋亡细胞占总肿瘤细胞的百分比,并做比较。

1.2.4 Phospho-Akt、Caspase3mRNA表达水平变化的检测 采用 Trizol总 RNA提取法提取总 RNA。然后将 3μg总 RNA逆转录成 cDNA。取 2μl cDNA加入25μl的 PCR扩增体系内,按表 1中反应条件进行。取 4μl扩增产物在质量浓度为 15 g/l的琼脂糖凝胶(内含 0.5μg/m l的溴化乙锭)电泳,时间 20～25 min,电压 100V,采用 Genesnap凝胶图像分析系统扫描扩增产物电泳条带的密度,计算产物的相对量:产物相对量 =产物电泳条带密度/β-actin产物电泳条带密度。

表1 Phospho-Akt和 Caspase 3的引物序列及反应条件

1.2.5 肿瘤体积测定及比较 用游标卡尺测定肿瘤最长径 L和最短径 W,以公式 V=L×W2/2计算肿瘤体积,计算出各组肿瘤的平均肿瘤体积并进行比较。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 11.5统计软件进行单向方差分析(One-way ANOVA),阳性细胞所占百分比的比较采用χ2检验,肿瘤平均体积采用 t检验。

2 结果

2.1 免疫组织化学

免疫组织化学结果显示:磷酸化 Akt蛋白(Phospho-Akt)在 FTY720治疗组(5mg/kg和 10 mg/kg)表达水平低于生理盐水对照组(P均 ＜0.05),而Caspase-3在 FTY 720治疗组 (5mg/kg和 10mg/kg)表达水平明显高于生理盐水对照组(P均 ＜0.05),而增殖细胞核抗原(PCNA)在 FTY720治疗组(5 mg/kg和 10mg/kg)表达水平要低于对照组 (P均 ＜0.05),提示FTY720可抑制激活的 PI3K-Akt信号通路,上调Caspase-3表达水平,诱导增强癌细胞凋亡,同时抑制降低肿瘤细胞增殖水平,见图 1～3。

图1 3组磷酸化 Akt蛋白表达比较

图2 3组 Caspase-3蛋白表达比较

2.2 TUNEL法凋亡检测结果

TUNEL法凋亡检测结果显示,FTY720治疗组(5 mg/kg和 10mg/kg)凋亡水平明显上调,远远高于生理盐水治疗组(P＜0.05和 P＜0.001),尤以 10mg/kg更为显著,见图 4。

2.3 肿瘤组织中 Phospho-Akt和 Caspase-3的 mRNA表达情况

根据 RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图绘制直方图(图5)。FTY 720治疗组(5mg/kg和 10mg/kg)的 Phospho-AktmRNA表达水平明显受到抑制(P均 ＜0.05),而Caspase-3 mRNA表达水平明显高于生理盐水对照组(P均 ＜0.05),提示 FTY720可以明显地抑制激活的PI3K-Akt信号通路,上调 Caspase-3表达,促进肿瘤细胞凋亡。

2.4 治疗结束后各组肿瘤体积的比较

采用 FTY720治疗 1个月后,处死裸鼠,并用标尺测量了肿瘤的长径和短径,以公式 V=L×W2/2计算肿瘤体积并做比较。由图 6可见,与生理盐水治疗组比较,FTY720治疗组(5mg/kg和 10 mg/kg)明显地抑制了肿瘤生长(P均 ＜0.05)。

图3 3组PCNA蛋白表达比较

图4 对照组和 FTY 720治疗组TUNEL法阳性细胞百分比比较

图5 对照组和治疗组的磷酸化 Akt和 Caspase-3m RNA表达水平比较

图6 对照组和FTY720治疗组肿瘤平均体积比较

3 讨论

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全世界第三大致死性肿瘤,也是我国最常见的恶性肿瘤之一。传统肝脏部分切除手术一直是治疗肝癌的首选方法,但肝癌的总体手术切除率仅有 20%左右,术后总体生存率也一直不高,其 5年生存率介于 13%～46%,术后容易复发和转移,难以实现根治[6]。

FTY720作为最近几年开发出来用于免疫抑制的药物,现已广泛应用于临床抗器官移植免疫排斥。但其肿瘤抑制效应最近才被科学家所发现,人们已发现它对多种肿瘤有抑制作用。Terence等[5]证实 FTY720对于多种肝癌肿瘤细胞系有明显地抑制作用。我们的实验结果也显示 FTY720对于人高转移性地肝癌细胞系 MHCC-97H移植瘤具有明显地抑制作用,能通过诱导肿瘤细胞凋亡,减缓和抑制移植瘤的生长。FTY720的治疗剂量为 5 mg/kg时,即可达到 4倍左右的肿瘤体积抑制效应,而当剂量提高到 10mg/kg是可以达到10倍左右的抑制效应,而裸鼠可以完全耐受治疗,取得比较满意地肿瘤治疗效果。

有研究发现 FTY720能明显地诱导肿瘤细胞凋亡,其诱导肿瘤细胞凋亡与 Caspase-3、Caspase8以及Bid的活化密切相关,而并不依赖于 Fas途径,但对bcl-2具有依从性,bcl-2的过量表达可以抑制凋亡[7]。Matsuoka等[8]发现 FTY720可以诱导人 T细胞白血病肿瘤细胞系 Jurkat细胞系出现 G0/G1期生长抑制,它通过促进 Akt、Bad和核糖体 p70S6激酶脱磷酸化,同时使 PPA2或 PPA2样的磷酸酶被激活,进而促进经由线粒体的细胞凋亡。Azuma等[2]研究发现 FTY720在抑制乳腺癌细胞系生长过程是呈剂量依赖关系的,FTY720治疗后改变了肿瘤细胞的骨架结构,整合素明显减少,这些改变将干扰肿瘤细胞的黏附,特别是对层黏连蛋白的黏附,从而阻断了肿瘤细胞在靶组织中的着床、播散和转移。此外,FTY 720还可能是通过抑制细胞外的信号调节激酶(ERK)来诱导肿瘤细胞凋亡[9]。FTY720的抗肿瘤作用与目前常用的化疗药物作用机制不同。FTY720诱导淋巴细胞凋亡而不影响造血系统其它细胞系如粒细胞、红细胞和巨噬细胞,也不抑制骨髓,说明诱导的凋亡并不是基于细胞毒作用的,FTY720可能激活了存在于肿瘤细胞和淋巴细胞之间的某种凋亡途径。

近年来发现,PI3K和其下游分子蛋白激酶 B(PKB或 Akt)所组成的信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关。该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关[10]。细胞凋亡是控制过度增殖的 1种正常细胞功能,癌细胞具有多种抑制凋亡、延长其存活的机制。Akt主要作用于抗凋亡通路,显性负效应 Akt通过多条途径诱导抑制凋亡,而肿瘤细胞中 PI3K-Akt信号通路常处于激活状态,肿瘤细胞的凋亡受到抑制,处于持续增殖无控制状态。我们的研究结果表明 FTY720确实可以下调处于激活 PI3K-Akt信号通路,促使蛋白激酶脱磷酸化,从而释放肿瘤细胞的凋亡抑制状态,促进和诱导肿瘤细胞凋亡。同时能够诱导活化 Caspase-3,表现出明显地抗肿瘤效应。但 FTY720具体分子机制仍不完全明了,还需要进一步地深入研究。

总之,FTY720不仅具有免疫抑制作用,而且还具有抗肿瘤效应。FTY720不仅可以用于抗器官移植术后的免疫排斥反应,而且能抑制移植术后肿瘤的复发和转移,这对肝癌肝移植患者更具重要意义。

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[4] Azuma H,Takahara S,Horie S,et al.Induction of apop tosis in human bladder cancer cells in vitro and in vivo caused by FTY 720 treatment〔J〕.JUrol,2003,169(6):2372.

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[6] El-Serag H B,Marrero JA,Rudolph L,etal.Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology,2008,134(6):1752.

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