HPLC法同时测定饲料预混料中维生素C（VC）和VC磷酸酯的含量

湖南农业大学食品科技学院 张春艳

广东海大集团畜牧水产研究中心 周孝治*

维生素C（VC）又称L-抗坏血酸，是动物生长发育过程中不可缺少的营养素之一（张辉等，2009），其结构中存在易氧化基团，在饲料加工、储藏和使用过程中稳定性较差（葛建东和杨凌，1998）。实际应用中，常将VC酯化为稳定的VC磷酸酯，但由于其酯化程度及加工工艺不同，饲料添加剂或预混料中VC磷酸酯常为单体VC和VC磷酸酯的混合物，因而其稳定性或利用率存在差异（张玮和尚平，2005）。

目前饲料添加剂中VC检测主要采用氧化还原滴定法和邻苯二胺荧光法，VC磷酸酯检测主要采用酶解法和紫外分光光度法。由于饲料预混料中干扰物质较多，采用这些方法操作步骤复杂，且不能区分单体VC和VC磷酸酯的含量，因而对不同厂家生产的饲料预混料中VC含量容易产生误判（张丽萍和吴小春，2002）。本文旨在建立饲料预混料中VC和VC磷酸酯含量同时测定的高效液相色谱（HPLC）法，以期获得简单快速、干扰少、回收率高、检测结果准确可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent1200型高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（DAD），Agilent Chem-Station色谱工作站；HERMLE-Z323型高速离心机；Sartorius-CP225D型电子分析天平；SCQ-3201A超声波清洗仪。

VC标准品（Dr.Ehrenstorfer公司，纯度 ≥99.0%），VC磷酸酯钠盐标准品（Fluka公司，纯度≥ 98.0%），乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾、磷酸为分析纯，实验用水为Millipore超纯水。

1.2 溶液配制 磷酸缓冲液的配制：准确称取40.83 g磷酸二氢钾用超纯水溶解稀释至1000 mL，用85%磷酸调节pH至4.0，然后用0.45 μm滤膜过滤，配制成0.3 mol/L磷酸二氢钾（pH 4.0）的缓冲溶液。

混合标准储备液的配制：准确称取VC和VC磷酸酯钠盐标准品各100.00 mg于100 mL棕色容量瓶中，用磷酸缓冲液溶解并定容至刻度，即成1000.0 mg/L的VC和VC磷酸酯钠盐混合标准储备液，于4℃冰箱避光保存。

1.3 试验样品 饲料预混料，由广东某研究中心提供。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱分析条件 色谱柱：Lichrospher-NH2分析柱（250 mm×4.0 mm i.d.，5 μm）；流动相：乙腈-磷酸缓冲液（30∶70，V/V）；检测器：DAD 检测器，检测波长为 254 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min。

1.4.2 样品的预处理 称取样品0.5～1 g（精确至0.0001 g）于100 mL棕色具塞三角瓶中，加入流动相50 mL，摇匀，于25℃水浴超声提取15 min，冷却静置2 min，取上层提取液约30 mL转入离心管中，以4000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm微孔滤器过滤，进HPLC分析。

1.4.3 标准曲线的绘制 用流动相将VC和VC磷酸酯钠盐混合标准储备液逐级稀释得到浓度为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L 和 200.0 mg/L 的一系列标准工作液，在选定的色谱条件下，将浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

1.4.4 样品的测定 按外标法，将各试样经HPLC检测所得的VC和VC磷酸酯钠盐色谱峰面积分别代入相应的标准曲线方程，得到样品中VC和VC磷酸酯钠盐的含量，其中VC磷酸酯钠盐含量再乘以VC磷酸酯钠盐转换为VC磷酸酯的系数0.7951，求得样品中VC磷酸酯的含量。

2 结果与讨论

2.1 样品预处理条件的选择

2.1.1 提取液的选择 由于VC和VC磷酸酯属于极性化合物，其中VC溶液热稳定性较差，在中性或碱性水溶液中易被氧化，但在酸性溶液中比较稳定，实验过程中分别用磷酸缓冲液（pH 4.0）和流动相作为提取液，考察了提取液对试样提取的影响。结果显示，采用流动相作为试样提取液时提取效果良好，且色谱峰形尖锐对称，因此选用流动相作为试样提取液。

2.1.2 提取条件的选择 实验选用流动相作为试样提取液，对提取温度（25、35、45、50 ℃）和提取时间（5、10、15、20 min） 两个条件参数进行了优化。结果表明：随着温度的升高，VC磷酸酯的提取效率加快，但单体VC的稳定性减弱；随着提取时间的增加，试样提取效率有所增加，当提取时间超过15 min时，提取液中杂质干扰增多，最终确定参数为：提取温度25℃，提取时间15 min。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 检测波长的选择 采用流动相作为背景缓冲液，对VC和VC磷酸酯标准液和样品溶液用二极管阵列检测器在190～400 nm进行全波长紫外扫描。结果表明，VC和VC磷酸酯两种物质在254 nm处相对吸收最大，且杂峰干扰少，本实验选择检测波长为254 nm。

2.2.2 色谱柱的选择 考察了 C18、C8和 NH2分析色谱柱对VC和VC磷酸酯分离效果的影响，由于VC和VC磷酸酯极性较强，在C18和C8分析柱上保留时间短，不能很好的与杂峰分离，但在具有极性官能团的NH2色谱柱上，VC、VC磷酸酯与杂峰之间分离效果良好，相对保留时间较长，故选择NH2色谱柱作为分离柱。

2.2.3 流动相的选择 由于VC在酸性介质中比较稳定，实验过程中考察了流动相磷酸缓冲液不同 pH 值（3.0、4.0、5.0）对色谱分离效果的影响。结果表明pH为4.0时，VC和VC磷酸酯吸收值较大，灵敏度高，色谱峰形对称，因此缓冲液pH选择为4.0。

实验过程中还分别通过调节磷酸缓冲液不同浓度（0.1、0.2、0.3 mol/L）和乙腈-磷酸缓冲液不同比例（20∶80、30∶70、40∶60，V/V）来改善色谱峰的分离效果。结果显示，随着磷酸缓冲液浓度的升高，色谱峰形和分离度越好；随着乙腈比例的升高，保留时间缩短，杂质干扰较大。当乙腈-磷酸缓冲液（0.3 mol/L）比例为 30∶70（V/V）时，目标峰与样品中的杂峰分离良好，色谱峰形尖锐、对称（见图1），在此色谱条件下VC和VC磷酸酯的保留时间分别为（4.10±0.05）min 和（8.12±0.05）min。

图1 不同样品中VC和VC磷酸酯的高效液相色谱图

2.3 标准曲线和方法检出限 在上述色谱条件下， 对 5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L 和 200.0 mg/L的VC和VC磷酸酯混合标准工作液进样分析，以HPLC测得的峰面积为纵坐标（y），相应的浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，得出VC和VC磷酸酯的线性回归方程、相关系数和线性范围，根据3倍信噪比（S/N=3）可计算出方法的检出限，结果见表1。试验结果表明，浓度为5.0～200.0 mg/L时，VC和VC磷酸酯线性关系良好，检出限分别为0.05 mg/L和0.1 mg/L。

表1 VC和VC磷酸酯的线性回归方程及检出限

2.4 方法的准确度和精密度 对未添加VC和VC磷酸酯的空白饲料预混料进行加标样品回收率和精密度实验，选择了 100.0、1000.0、5000.0 mg/kg三个添加水平，每个浓度平行测定5次，重复3 d，结果见表2。

从表2中的数据可以看出，添加浓度为100.0～5000.0 mg/kg时，饲料预混料样品中VC和VC磷酸酯的平均回收率为95.6%～99.1%，日内相对标准偏差为0.97%～1.76%，日间相对标准偏差为1.98%～3.84%，方法检测的准确度和精密度良好，满足分析的要求。

表2 饲料预混料中VC和VC磷酸酯的回收率和精密度测定

2.5 样品测定 按本文所建立的方法测定了A、B、C、D、E五种不同饲料预混料样品中VC和VC磷酸酯的含量，将VC磷酸酯含量转换为VC含量（VC磷酸酯转换为VC的系数按0.6876计），与所测单体VC含量之和得到总VC含量。结果如表3所示，五种不同饲料预混料添加的总VC含量大致相同，约为5500 mg/kg，但其中单体VC含量和VC磷酸酯含量却各不相同，存在较大差异。

表3 不同饲料预混料中VC、VC磷酸酯和总VC含量

3 结论

采用高效液相色谱法检测饲料预混料中VC和VC磷酸酯含量，其检测结果准确度高，平均回收率在95.6%～99.1%，重现性好，日内相对标准偏差在0.97%～1.76%，日间相对标准偏差在1.98%～3.84%，样品的预处理简单快速，不受样品中其他组分的干扰，适用于饲料预混料中VC和VC磷酸酯的快速定量分析测定。

[1]葛建东，杨凌.饲料工艺对预混料中维生素的影响[J].饲料研究，1998，1：15～17.

[2]张辉，牟振波，单安山，等.鱼类的维生素 C 营养[J].饲料工业，2009，30（8）：48～50.

[3]张丽萍，吴小春.国内维生素C仪器定量分析进展[J].四川轻化工学院学报，2002，12（15）：34 ～42.

[4]张玮，尚平.稳定性维生素C源的提纯工艺研究[J].石家庄职业技术学院学报，2005，6：24 ～25.