免疫亲和柱-高效液相色谱法检测青贮饲料中的呕吐毒素

2010-04-28中国农业科学院饲料研究所董颖超李军国牛力斌

中国饲料 2010年10期

中国农业科学院饲料研究所董颖超李俊李军国牛力斌

青贮饲料是指经人工调剂的多汁青饲料，多用于反刍动物的冬春季节饲喂，对泌乳奶牛尤为重要。李春杰等（2009）认为，在青贮过程中导致青贮饲料受霉菌毒素的污染主要有以下两个原因：一是青贮原料在贮前已被霉菌污染，二是由于青贮制作中水分含量低于70%，水分不足不仅影响乳酸菌微生物的发酵，而且使空气难以排净，引起了霉变。奶牛进食受霉菌毒素污染的饲料后，不仅会影响奶牛的生产性能，而且还影响原料奶的安全性，造成奶牛养殖业的经济损失，因此有必要建立检测方法以便监控奶牛青贮饲料中霉菌毒素的污染状况。

呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是霉菌毒素的一种，可导致动物肠功能紊乱（腹泻、呕吐），口腔黏膜和真皮损伤，免疫力下降（孟昭赫，1990）。目前用于检测DON的方法主要有酶联免疫吸附（ELISA）法、薄层层析（TLC）法和高效液相色谱（HPLC）法。ELISA法重现性差，假阳性问题严重，TLC法对环境和操作人员的污染较大，而HPLC法具有灵敏性高，检测时间短等优点。目前鲜见检测青贮饲料中DON的检测方法报道，本研究旨在通过建立青贮饲料中检测DON的液相色谱法，为进一步掌握青贮饲料中DON的污染水平提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料奶牛用玉米青贮饲料样品1、2分别取自天津某公司和天津某奶牛养殖场。

1.2 试剂甲醇（色谱纯），购自Thermo-Fisher公司；纯水，18MΩ，取自 Millipore系统；DONtest HPLC免疫亲合柱，购自北京中检维康Vicom公司；聚乙二醇8000，购自北京化学试剂公司；呕吐毒素（纯度 ≥ 98%），购自Sigma-Aldrich公司；GM200均质机，德国Retsch公司；EYELA MG2200型氮吹仪，日本精工公司。

1.3 色谱条件液相系统为Agilent 1100系列，配可变波长检测器（VWD），色谱柱为Eclipse XDB C18反相柱（4.6 mm×150 mm i.d.，5 μm）；进样量为 50 μL；流动相为 15∶85（V/V）的乙腈水溶液；流速为 1.0 mL/min；等度洗脱；检测波长220 nm。

1.4 样品处理方法将青贮饲料样品于-20℃冰箱内冷冻保藏，检测前于100℃烘箱内烘干2 h后，粉碎，过20目筛，加入一定量聚乙二醇8000，200 mL提取液，Retsch磨 5000 r/min下高速均质2 min后，过微纤维滤纸，取一定量滤液，过经纯水冲洗的免疫亲和柱，用一定量色谱级甲醇淋洗柱子，将样品淋洗液，氮气吹干，用1 mL甲醇定容，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化为充分提取样品中的DON，采用的溶剂组合为甲醇水溶液体系，分别以纯水、甲醇-水（V/V，20∶80）、甲醇-水（V/V，40∶60）的混合液作为提取液，其他条件不变，考察不同提取液对提取效果的影响。结果发现，提高提取液中甲醇的比例，DON的回收率会略微降低，但混合液中水的比例高时会淋洗出更多的杂质，导致基线噪音加大，干扰测定。综合考虑选择甲醇-水（V/V，20∶80）作为样品提取液。图1为浓度为1.0 mg/L的DON标准品的高效液相色谱图，故将样品1、2的添加水平设为1.0 mg/kg进行检测，色谱图见图2。