枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能与肠道黏膜形态的影响

苏州大学基础医学与生物科学学院 邱 燕 蔡春芳 代小芳 叶元土＊ 尹晓静 张 俊 谭芳芳

随着水产养殖业的发展和抗生素的广泛应用，抗生素的缺点逐渐暴露出来，抗生素滥用不但起不到防病增产的目的，反而造成动物肠道内致病菌的抗药性以及水产品中的药物残留问题，进而影响人类的身体健康。微生态制剂作为可替代抗生素的一种饲料添加剂已经引起人们的广泛重视（Hwang等，2008）。其中，枯草芽孢杆菌以其抗菌性能好、稳定性强及对水产动物的益生作用受到广大研究者的青睐。本试验旨在探讨枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能的影响，为枯草芽孢杆菌在草鱼饲料中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 芽孢杆菌属：枯草芽孢杆菌，活菌数达到2.0×109CFU/g。草鱼：由无锡宜兴养殖厂提供，平均体重（69.51±6.29）g，共 240 尾。

1.2 试验设计及日粮组成 试验草鱼随机分为5组，以基础饲料作为对照组；在基础饲料中分别添加 1000、1500、2000 mg/kg 和 2500 mg/kg 的枯草芽孢杆菌作为4个试验组，共5个组。每组3个重复，每个重复16尾鱼，基础日粮组成及营养水平见表1。饲料原料经微粉碎后过40目筛，混合均匀后用小型颗粒饲料机加工成直径1.5 mm的颗粒饲料备用，饲料加工过程中温度65～70℃，持续时间约1 min。

表1 基础日粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 饲养管理 在50亩的池塘中设置网箱进行养殖试验，网箱规格为1 m×1 m×1.5 m，本试验共15个网箱。试验鱼经过2周的养殖驯化后再进行分组。饲料投喂每天3次，投喂量为体重的2%～3%。试验时间为2008年8～10月，饲养期间水质条件为：水温（28.0 ± 3.0）℃，DO ＞ 8.0 mg/L，pH＜8.3，亚硝酸盐＜0.01 mg/L，硫化物＜0.05 mg/L。正试期70 d。

1.4 样品采集和分析 饲养试验结束后，禁食24 h后测定每箱鱼的总体重和尾数，计算成活率、饲料系数、特定生长率。解剖试验鱼，取出内脏团，分离出肠道，剔除表面脂肪组织，分别取中肠1 cm左右的组织1～2块，纵向剖开，使肠黏膜暴露于空气中，用生理盐水冲洗3～4次，除去其上所带有的血液、粪便等杂质，制得肠道样品。

扫描电镜肠道样品置于4%戊二醛固定液中，超声波洗涤10 min，更换固定液再次洗涤，更换固定液保存。制样时将其取出，洗涤，适当修剪，1%锇酸固定1 h，0.1 mol/L pH 7.2磷酸缓冲液洗3次，叔丁醇系列梯度脱水，真空干燥，喷金，S-4700型冷场发射扫描电镜观察、拍照。

组织切片肠道样品置于4%中性甲醛中固定、70%乙醇保存。分别经浓度为70%、80%、90%、95%以及100%的酒精梯度脱水，并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔点石蜡中。使用KD-2508型切片机横向连续切片，厚度为8 μm，而后展片于清洁的载玻片上。采用H.E染色，中性树胶封片。显微测量肠道皱襞高度、宽度，黏膜层、肌层、浆膜层厚度，光学显微镜下观察并采用Nikon COOLPIX4500型相机进行拍照。

1.5 计算公式

成活率/%＝（试验末鱼尾数/试验初鱼尾数）×100；

特定生长率/（%/d）＝（ln 末均重－ln 初均重）/饲养天数×100；

饲料系数＝每个网箱投喂饲料总量/每个网箱鱼体总增重量。

1.6 数据处理 采用Excel进行数据处理，采用SPSS 14.0版统计软件中One-Way ANOVA过程进行方差分析，并进行Duncan’s多重比较，显著水平为0.05，试验数据用“平均数±标准差”表示。

2 结果

2.1 枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能的影响 见表2。各试验组成活率均为100%，对照组为98%。在特定生长率方面：与对照组相比，各试验组分别增加了 12.77%、22.34%、30.85%和5.32%；其中，枯草芽孢杆菌以2000 mg/kg组显著高于对照组（P＜0.05），其他各组之间差异不显著（P＞0.05）。在饲料系数方面：与对照组相比，各试验组分别下降了16.46%、26.16%、31.22%、5.06%，其中2000 mg/kg组显著低于对照组（P＜0.05），其余各组间差异不显著（P ＞0.05）。

2.2 枯草芽孢杆菌对草鱼肠道黏膜形态的影响

2.2.1 肠道皱襞观察 结果见表3，各试验组均高于对照组，其中1500 mg/kg和2500 mg/kg组显著高于对照组（P＜0.05）；黏膜层厚度与皱襞高度表现一致。各试验组皱襞宽度、肌层厚度、浆膜层厚度均与对照组差异不显著（P＞0.05）。

2.2.2 肠道微绒毛观察 结果见表4，除1500 mg/kg组外，其余试验组微绒毛高度均高于对照组，其中1000 mg/kg和2500 mg/kg组显著高于对照组（P＜0.05）。各试验组微绒毛宽度均显著高于对照组（P＜0.05），微绒毛密度均高于对照组（P＞0.05）。

表2 枯草芽孢杆菌对草鱼成活率、特定生长率和饲料系数的影响

表3 枯草芽孢杆菌对草鱼肠道皱襞的影响μm

表4 枯草芽孢杆菌对草鱼肠道微绒毛的影响

3 讨论

本试验结果表明，枯草芽孢杆菌具有显著提高草鱼生长性能的作用。各试验组草鱼特定生长率均比对照组增加5%以上，其中2000 mg/kg组显著高于对照组，增加了30.85%；各试验组饲料系数与对照组相比，下降了5%以上，其中2000 mg/kg组显著低于对照组，下降了31.22%。这与刘云高（1994）、王子彦等（1994）报道结果一致。

本试验各试验组肠道皱襞高度均高于对照组，其中1500 mg/kg和2500 mg/kg组皱襞高度显著高于对照组。肠道皱襞的高度增加，能够增大肠内表面积从而使肠道的吸收面积、肠道与食物的接触面积增大，因而消化功能增强。

微绒毛是肠道的特有结构，它的高矮和密度大小直接影响肠道的吸收面积。马力等（1989）研究表明，肠黏膜上皮游离端纹状缘（微绒毛）含有多种消化酶，具有消化吸收的双重作用。本试验通过对草鱼肠道扫描电镜的观察可知，各试验组微绒毛高度均高于对照组，其中1000 mg/kg和2500 mg/kg组显著高于对照组，各试验组微绒毛宽度均显著高于对照组，各试验组微绒毛密度均高于对照组，表明枯草芽孢杆菌能够促进草鱼肠道微绒毛的生长发育，通过显著增加微绒毛高度、宽度，并增加其密度来增加肠道的吸收面积，增强肠道的消化吸收能力，提高饲料利用率，从而促进草鱼的生长。

本试验枯草芽孢杆菌添加到2500 mg/kg，特定生长率有下降的趋势且饲料系数有所增加，可能由于过量添加枯草芽孢杆菌导致鱼体内菌群比例失调，生产性能下降。此外，芽孢杆菌产生过量的酶也有可能抑制动物体内内源酶的活性，降低内源酶对营养物质的分解作用，从而降低了生长性能，这与王爱民（2003）、刘迎春（1996）报道在鱼类饲料中添加一定的外源酶能促进鱼体生长，过量的外源酶降低鱼体的生长性能的研究结果相似。

4 结论

适量添加枯草芽孢杆菌能够通过改善草鱼肠道黏膜形态，促进草鱼对营养物质的吸收利用，从而促进草鱼生长。

[1]刘云高，杨明高，胡未一，等.鱼用微生物饲料添加剂（8801）对鲤鱼促生长试验[J].四川农业大学学报，1994，增刊：650～653.

[2]刘迎春.饲用复合酶对产蛋鸡低蛋白饲粮氨基酸可利用率的影响：[硕士学位论文][D].南京：南京农业大学，1996.

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[4]王爱民.外源酶对内源酶活性、肠道组织及生产性能的影响研究：[硕士学位论文][D].南京：南京农业大学，2003.

[5]王子彦，何明清，陈孝跃，等.鱼用微生物饲料添加剂在不同营养水平下对鱼的促生长研究[J].四川农业大学学报，1994，增刊：658～661.

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