应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

卢 宁, 赵龙凤, 李 红, 郝彦琴, 黄丽丽 (山西医科大学第一临床医学院感染科, 太原 030001; 通讯作者,Tel:0351-4639004)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其具有强大的多向分化潜能及自我更新能力,且由于其易于分离培养扩增的特性而日益受到关注[1-3]。但骨髓中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)含量极低,每 10万个单个核细胞中大约只有 1个 MSC[3]。因而,本实验旨在探讨适宜的方法在体外获得大量优质的 BMSCs,以使其更好地服务于基础及临床研究。

图4 BMSCs表型的免疫细胞化学染色 (×400)Fig 4 Immunocytochem istry of phenotype of BMSCs(×400)

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂 清洁级健康雄性 Wistar大鼠(山西医科大学实验动物中心提供)。实验试剂:DMEM-F12培养基(美国 Hyclone公司);胎牛血清(中国杭州四季青生物公司);胰蛋白酶(美国 sigma公司);兔抗大鼠 CD34、CD44、CD45(中国北京博奥森公司);3110型 CO2恒温培养箱(美国 Thermo公司);CKX41型倒置显微镜(日本 OLYMPUS);SWCJ-IFD超净工作台(中国苏净集团安康公司);KDC-40低速离心机(中国科大创新股份有限公司中佳分公司);流式细胞仪(美国 Becton Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的体外分离及原代培养 取清洁级健康雄性 Wistar大鼠,体重约 150 g,脱臼处死。首先用 75%酒精浸泡消毒 5min,然后用已提前消毒的手术器械无菌分离四肢长骨,去除骨膜及残留肌肉,剪去长骨两端,暴露髓腔后用注射器吸取 DMEM液反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液,离心(1 200 r/min,共 10min),弃上清。用含 20%胎牛血清的 DMEMF12培养基反复吹打重悬细胞,制成单细胞悬液,计数后以 1×109/ml密度接种于培养瓶(25 cm2),标记为 P0,置于 37℃、5%CO2孵箱内,旋开半档瓶盖培养。24 h后进行半量换液,以后每 2-3 d换液,弃去未贴壁细胞以达到纯化的目的,当贴壁细胞长到 80%融合时结束原代培养。

1.2.2 BMSCs传代扩增 原代细胞达 80%融合时进行传代培养。将培养瓶中的培养液倒掉,再用PBS液冲洗 2次以除去残留血清,每瓶加入 0.25%胰酶 2ml进行消化,在镜下观察可见细胞皱缩,体积逐渐变小,此时终止消化,消化时间约 2-3 min,进行吹打以吹落贴壁细胞,移入离心管后进行离心(1 200 r/min,共 5 min),弃上清。用含 10%胎牛血清的 DMEM-F12培养基重悬细胞后接种于培养瓶,标记为 P1,按 1∶2比例进行传代。以后 2-3 d换液。重复上述步骤进行 P2、P3及 P4代的传代培养。

1.2.3 观察细胞形态 采用倒置显微镜进行观察,并拍照。

1.2.4 测定 BMSCs细胞生长曲线 取生长状态良好的 P3代细胞,以 PBS液冲洗 2遍后用 0.25%胰酶消化贴壁细胞,终止后用吸管反复吹打制成细胞悬液,再按 1.3×105/ml接种于 24孔板,每日取 2孔进行计数,取平均值,连续计数12 d。以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。

1.2.5 BMSCs细胞周期测定 取 P3代细胞,PBS液冲洗后用胰酶消化,用 PBS液制成单细胞悬液,离心(1 200 r/min,共 5 min),重复 2次,用 75%冷乙醇固定,离心后弃去上清加入 PI染液避光孵育30min,用流式细胞仪检测细胞周期,重复 3次。

1.2.6 BMSCs细胞表型鉴定 取生长状态良好的P3代细胞,制成细胞爬片,用 95%乙醇固定 30min,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,0.1%TritonX-100通透,10%BSA封闭,将一抗 (兔抗大鼠 CD34、CD44、CD45)分别加于不同的切片上 4℃过夜,同时用 PBS作为空白对照。次日加生物素化二抗后37℃下孵育 30min,加 SABC,DAB显色,苏木素复染、脱水封片后观察。

2 结果

2.1 细胞生长情况 取大鼠骨髓培养的原代细胞,接种后镜下观察显示,细胞大小均一,呈圆形,胞体透亮。24 h进行第一次换液,除去未贴壁细胞。培养 3-5 d后,可见大多数细胞贴壁,并逐渐伸出伪足,呈圆形或多边形,胞核位于细胞中央,集落生长,此时细胞增长迅速,于培养 7-10 d细胞渐渐铺满培养瓶,达到 80%融合后结束原代培养,进行传代扩增。传代培养的细胞,贴壁较原代迅速,24 h即完全贴壁,大多数细胞形态多呈长梭形,体积较大,增殖迅速,约 5-7 d后再次增殖,见图 1。

图1 BMSCs的形态学变化Fig 1 Themorphological changes of BMSCs

2.2 BMSCs生长曲线 细胞培养第4天时开始迅速增长,进入指数增生期,6 d后进入平台期,见图 2。

2.3 BMSCs细胞周期 经流式细胞术行细胞周期检测,P3代 BMSCs处于 G0/G1期的细胞为 81.49%,G2期的细胞为 8.33%,S期的细胞为 10.10%,这说明大多数细胞处于静止期,符合干细胞的特征,见图 3。

2.4 BMSCs细胞表型鉴定 经免疫细胞化学鉴定结果显示,CD44阳性,CD34、CD45阴性,见图 4(见封3)。

图2 BMSCs生长曲线Fig 2 The growth curve of BMSCs

图3 P3代BMSCs细胞周期流式图Fig 3 The cell cycle of P3BMSCs by flow cytometry

3 讨论

3.1 获得较高纯度 BMSCs的意义 BMSCs最先由Friedenstein等[4]发现,并于 1974年首次成功于体外分离培养获得。经大量研究证实,BMSCs可以在不同诱导条件下分化为中胚层及神经外胚层组织细胞,如心肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞等[5-7],因而 BMSCs是目前基础及临床研究中的热点。由于骨髓中的 MSCs含量极少,并随年龄的增长而减少,获得较高纯度的 BMSCs对于进一步研究具有重要的意义。

3.2 选择全骨髓贴壁法获取 BMSCs的原因 目前体外获得 BMSCs的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法以及免疫磁珠分选法,因其各具优缺点,所以国内外学者在选取何种方法可以经济、简便地获取较高纯度的 BMSCs方面并未达成一致[8]。密度梯度离心法是一种根据骨髓中MSCs与其他细胞的密度不同而采用 Ficoll及 Percoll分离液进行分离,从而获得 MSCs的方法。虽然此法对细胞活性影响小,但容易造成大量细胞的流失,且操作复杂。全骨髓贴壁法是根据 BMSCs的贴壁特性通过定期换液除去不贴壁的细胞,如造血系细胞、内皮细胞等,以达到分离纯化的目的。该法操作简便,可以获取纯度较高的 BMSCs,较其他方法节省费用,并可最大程度地减少污染的机会。本实验应用全骨髓贴壁法在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增至 3代以后在倒置显微镜下观察,大多数细胞形态呈长梭形,并呈集落样生长。经免疫细胞化学方法鉴定其表面标志,结果显示 CD44为阳性,而 CD34及 CD45造血干细胞表面标志则为阴性,说明在此法下获取了较高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,为进一步进行基础及临床研究提供基础。

3.3 培养条件的选择 在分离培养过程中,培养条件是获得较高纯度 BMSCs的关键。首先是细胞培养基的选择。王文等[9]在比较不同分离方法及培养条件下骨髓间充质干细胞生长增殖情况的研究中,分别选用 DMEM-F12培养基及 DMEM培养基进行培养,结果发现活细胞率分别为 97.7%及97.1%,因而在进行 BMSCs培养时以 DMEM-F12培养基为佳,这可能与 DMEM-F12培养基既具有DMEM的营养成分含量高的特点,又具有 F12含更多非必需氨基酸及维生素的特点有关。因而本实验选用 DMEM-F12作为培养基,在细胞培养过程中细胞的生长状态较好,利于获得数量较多的 BMSCs。其次是传代时消化时间的掌握。全骨髓贴壁法不仅要根据不同细胞的贴壁性来去除杂质细胞,也通过细胞所需消化时间的不同来达到纯化的目的。在培养过程中,成纤维细胞的贴壁性好,形态与 BMSCs类似,很难通过换液去除,但其所需消化时间比 BMSCs长,故可以在传代时通过胰酶消化时间的长短来达到纯化的目的。我们在实验过程中不断探索发现,在传代时,每瓶细胞(细胞数约 105/瓶)需要 0.25%胰酶约 2-3ml,待细胞稍见回缩、形态改变即终止消化,时间约为 2 min,这样不仅可以有效地去除成纤维细胞而得到较纯的 BMSCs,同时也可以维持细胞的活性。此外,细胞的接种密度对于 BMSCs的生长具有重要意义。当细胞接种密度过大,细胞的生长空间受到限制,不利于生长;而接种密度过小时,细胞又容易老化。因而,在原代培养时,应掌握适当的接种密度。庄淑波等[10]比较不同接种密度对细胞生长的影响时发现 1×109/ml组细胞出现伸展的时间及原代培养细胞融合时间较其他密度组要早,因而本实验在原代培养时按 1×109/ml接种,在培养 3-5 d细胞即贴壁并逐渐伸出伪足。

本实验分离培养所得的 BMSCs在镜下观察可见其呈长梭形,体积较大,单核,呈集落样及吹风样生长。选取生长状态良好的 P3代细胞测定细胞生长曲线显示细胞在培养的第 4-5天迅速增长,进入指数增生期,7-10 d后进入平台期。在增殖过程中,干细胞处于相对静止状态,由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充任务[11]。基于这一特性,本研究对 P3代 BMSCs行细胞周期检测,结果显示,81.49%的细胞处于 G0/G1期,G2期的细胞为8.33%,S期的细胞为 10.10%,表明绝大多数细胞处于相对不活跃的静止期,这与BMSCs的基本特征相符。对分离的 BMSCs行免疫细胞化学鉴定其表型,结果显示,CD44为阳性,CD34及 CD 45均为阴性,与 BMSCs的表型特征相符合。由此可知,本实验室应用全骨髓培养法获得的细胞从形态、生长动力学及细胞表型上均符合 BMSCs特征,对进一步利用 BMSCs进行基础及临床研究具有重要意义。

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