车前子不同炮制品多糖含量测定

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(1.温州市第三人民医院，浙江 温州 325000；2.温州医学院 仁济学院，浙江 温州 325035)

《中国药典》[1]记载，车前子为车前科植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟种子， 具有清热利尿、渗湿通淋、明目、祛痰的功能，用于治疗水肿胀满、热淋涩痛、暑湿泄泻、目赤肿痛、痰热咳嗽。在临床上可治各种病症[2]。目前，国内外对车前子多糖的研究表明,车前子多糖具有抗炎、缓泄、抗衰老、抗氧化、清除自由基、保护动脉内皮、整肠通便、降低血脂、调节血糖的作用[3-11]。车前子多糖的主要组成单糖是木糖和阿拉伯糖等戊糖[12],殷军艺等[13]对大粒车前子多糖分离、纯化及单糖组成分析的研究中，经GC-MS分析确定PLP由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖构成，其摩尔比为5.6∶9.4∶1.3∶1，但文献报道中车前子多糖测定通常都是以己糖(如葡萄糖)作为标准对照品。所以本实验采用周超等[14]在研究中建立的一种准确测定车前子多糖的方法，即采用苯酚-硫酸法测定车前子中多糖量，以木糖作为标准对照物，检测波长480 nm，希望更准确地测定车前子中多糖的含量。为在选用车前子的不同炮制品时，提供量的参考。

1 实验部分

1.1 实验材料 751-GW分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司),80-2离心机(上海手术器械厂)，隔膜真空泵(天津市津藤实验设备有限公司)，单相电容运转电动机(上海申生科技有限公司)，美的多功能电磁炉(广东美的生活电器制造有限公司)，万用电热器(浙江嘉兴市风桥电热器厂制造)，分析天平，冰箱，透析袋，回流装置，容量瓶(25、100 mL)，移液管(0.5、1、5 mL)，离心管，烧杯，玻璃棒；D-木糖，80%，95%乙醇，无水乙醇，丙酮，乙醚，氯仿-正丁醇(4∶1)，3%苯酚，浓硫酸，蒸馏水，自来水；车前子，自然晒干。

1.2 实验方法

1.2.1 车前子的炮制 历史沿革：宋代有酒浸(《总录》)、微炒(《局方》)、焙(《宝产》)、酒蒸(《济生方》)等炮制方法。明代还有米泔水浸蒸(《醒斋》)的方法。清代又增加了青盐水(《幼幼集成》)。并有“酒蒸捣碎，入滋补药；炒研，入利水泄泻药”(《备要》)的记载。现在主要的炮制方法有炒黄、盐炙等。生品车前子：取车前子，除杂质，筛去灰屑。清炒车前子：取净车前子，置炒制容器内，用文火加热，炒至略有爆声，并有香气逸出时，取出晾凉。盐炙车前子：取净车前子，置炒制容器内，用文火加热，炒至略有爆鸣声时，喷淋盐水，炒干，取出晾凉。

1.2.2 车前子多糖的提取与精制 称取干燥的生品车前子50 g,加8倍量体积分数80%乙醇浸泡24 h，过滤，挥干乙醇，加水于沸水浴中回流提取3 h,纱布两层过滤，滤渣再回流提取2 h，合并滤液，浓缩，加95%乙醇至醇浓度达到80%，冰箱中冷藏过夜。次日离心分离(4 000 r/min，10 min)，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤两次，干燥得生品车前子粗多糖，称量。做2分，其中1分精制，备用。生品车前子粗多糖用蒸馏水溶解，Seva ge法除蛋白[15]，然后用流动自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h，透析液浓缩,加95%乙醇至醇浓度达到80%，冰箱中冷藏过夜。次日离心分离(4 000 r/min，10 min)，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2次，干燥得生品车前子精多糖，称量。

1.2.3 标准曲线的绘制 准确称取干燥至恒量的D-木糖标准品25.10 mg,置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水配成0.251 0 mg/mL的溶液。准确移取此溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分别置于25 mL容量瓶中，稀释至刻度，配成系列标准溶液，浓度为0.005，0.010，0.015，0.020，0.025，0.030，0.035 mg/mL。最佳显色条件：在上述配制的系列溶液中分别取2.0 mL，加3%苯酚0.5 mL，摇匀后加浓硫酸4.0 mL,充分混合均匀，25℃室温放置35 min，在480 nm处测量吸光度。

1.2.4 换算因子的测定 精密称取生品车前子的精制多糖0.030 0 g，配制成0.03 mg/mL，按照1.2.3确定的最佳显色条件,由回归方程求出生品车前子精制多糖液中木糖的浓度。按下式计算换算因子f=m/(C·D)。式中:m-称取精制多糖的质量(mg)，C-精制车前子多糖中木糖的质量浓度(mg/mL)，D-多糖的稀释因素(mL)。

1.2.5 样品中车前子多糖的测定 精密称取生品车前子粗多糖0.030 0 g，配制成0.03 mg/mL,按照1.2.3确定的最佳显色条件，由回归方程求出生品车前子精制多糖液中木糖的浓度。按下式计算样品中多糖的量:W/%=C·D·f/m×100。式中:C-供试液中木糖的浓度(mg/mL)，D-多糖的稀释因素，f-换算因子，m-供试车前子多糖的质量(mg)。清炒和盐炙的车前子粗多糖都作同等条件的处理，分别得出相应的多糖含量。

2 结果

2.1 标准曲线 在确定的最佳显色条件下测定吸光度，以吸光度(A)对木糖浓度(C)作回归处理，得回归方程：C=0.030 3 A-0.000 7，R=0.999 6。木糖标准品在0～0.035 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.2 换算因子 经过对精制车前子多糖吸光度的测定，并计算后，求得车前子多糖相对于D-木糖的换算因子：f=1.571。

2.3 多糖含量 经过对粗品车前子不同炮制品的吸光度测定，由回归方程求出相应的车前子精制多糖液中木糖的浓度，并通过计算，得出结果。如表1。

表1 车前子不同炮制品多糖含量测定结果

2.4 精密度试验 准确移取0.03 mg/mL粗多糖样品溶液2 mL，按照1.2.3确定的最佳显色条件，平行测定5份。相对标准偏差RSD=0.98%。

2.5 稳定性试验 准确移取0.03 mg/mL粗多糖样品溶液2 mL，按照1.2.3确定的最佳显色条件，间隔15 min读取显色后的样品溶液吸光度，连续1 h考察其稳定性。相对标准偏差RSD=0.44%。

2.6 加标回收率 准确移取0.03 mg/mL粗多糖样品溶液2 mL,加入不同浓度的木糖标准溶液各1 mL，按照1.2.3确定的最佳显色条件，计算回收率(平行测定2次)。结果见表2。

表2 加标回收率测定结果

3 讨论

本次实验测定车前子多糖含量采用苯酚-硫酸法，检测波长为480 nm，由于车前子多糖的主要组成单糖是木糖和阿拉伯糖等戊糖[12],所以本实验以D-木糖作为标准对照品，这与以往文献报道中车前子多糖测定通常都是以己糖(如葡萄糖)作为标准对照品所不同,利用D-木糖与精制多糖的换算因子计算多糖量，得出的结果更能准确地反映其真实值。

通过对车前子不同炮制品多糖含量的测定，不难发现炮制后的车前子多糖含量较生品均降低，王东等[16]对车前子及其炮制品中多糖含量的分析研究结果中表明,3种车前子炮制品，无论是清炒还是盐炙，其多糖含量较生品都有所降低，与本实验结果相符。

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