三硝基甲苯对斑马鱼半致死浓度和致畸率的测定

谢 松,王 佳,叶正芳,卢胜涛,郭 华

(1.河北大学生命科学学院,河北保定071002;2.北京大学环境技术研究中心,北京100871;3.河北大学 图书馆,河北 保定 071002)

1 引言

2,4,6-三硝基甲苯(TNT)是一种军事和民用广泛应用的含能材料,用量居首位[1],具有高毒性和致变性,它可通过呼吸系统、消化系统及皮肤而进入生物体内,导致血相改变、紫绀、白内障、正铁血红蛋白血症和中毒性肝炎等。由于土壤对 TNT有很强的吸附作用,因而如果废水中的 TNT不经过处理直接排放,TNT就会很快渗入地下,积存于土壤中,将严重危害环境,TNT对水体和土壤环境的污染早已受到重视。由于TNT废水的化学稳定性及生物毒性,单独使用一项技术处理该废水,很难达有效的控制 TNT的含量[2～5]。

斑马鱼(Danio rerio,俗称zebra fish)是常见的暖水性(21～32 ℃)观赏鱼,鲤科,个体小(4～5cm),是标准实验生物之一,其作为生态毒理学的实验动物模型广泛应用于环境毒理试验研究中[6～7]。斑马鱼作为模式生物,可以通过检测乙酰胆碱酯酶的活性、谷胱甘肽S-转移酶的活性、P450酶系(属于单加氧酶(monooxygenase),又称为多功能氧化酶(m ixed function oxidase)、羟化酶(hydroxy lase),因其还原态的吸收峰在450nm处,故名。)7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)的活性进一步分析不同浓度的有毒物质的不同代谢反应,从而为废水处理提供有利的数据参考[8～10]。

目前,斑马鱼急性毒性实验是监测工业污染及污水检测的重要手段之一[11]。随着发育生物学和分子遗传学领域的研究进展,应用斑马鱼胚胎来研究污染物的致毒机理将成为生态研究中的重要手段。斑马鱼胚胎发育直至孵化的72h内可以观察到近20种不同表现的反应指标,见表1[12]。

表1 可以观察的毒理学终点

鉴于胚胎毒性测试对于绝大多数化学物质的敏感度高于成鱼急性毒性实验,经济合作与发展组织(OECD)在1998年将上述方法列入测定单一化学品毒性的标准方法之一,并制定了详细的操作指南(OECD TG212)[13]。现在,这项技术已经被广泛应用于环境有毒物质的生态风险乃至人类安全的评估中。随着中国经济和国防事业的飞速发展,爆破器材的研发和应用,使得三硝基甲苯,对河流和空气造成了一定的污染。本试验通过不同浓度的三硝基甲苯溶液对斑马鱼的致死程度不同来计算其半致死浓度。在污水处理方面有重要作用。

2 材料和方法

试验容器选用1L烧杯、试验用水为经曝气的自来水、试验鱼苗购于河北省保定市花鸟鱼虫市场、三硝基甲苯购于试剂公司。

2.1 TNT浓度测定

由于TNT属于难溶于水,所以不能保证所加TNT粉末在短时间内完全溶于水,这对试验的进度和准确度造成了影响,于是采用配置高浓度 TNT溶液,使用时再稀释的方法进行试验。

2.1.1 TNT溶液配制

取30mgTNT粉末置于500m L蒸馏水中,25℃水浴中放置一周左右,期间随时晃动,待用是将未溶的TNT过滤,得到高浓度 TNT溶液母液,备用。再通过亚硫酸钠-氯化十四烷基吡啶分光光度法测定溶液中TNT的含量。

2.1.2 绘制标准曲线

取6个25m L的容量瓶,分别加入10mg◦L-1TNT 标准溶液 0.5 、1、3 、5、7 、10m L,依次加入 10%亚硫酸钠溶液2m L,0.5%氯化十四烷基吡啶溶液2m L,然后稀释到刻度,混匀后用2cm比色皿,以蒸馏水作为空白参比,在466nm波长处,测量吸光度。绘制出测定TNT的标准曲线,当25m L溶液中含有TNT0～100μg时,符合比尔定律,标准曲线的相关系数大于 0.999[14～16],见图1。

图1 TNT标准曲线

2.1.3 自制TNT溶液浓度测定

通过分光光度计测量吸光度和标准曲线的对比,测的1m L自制 TNT溶液中 TNT含量为45.017μg。

2.2 试验鱼处理

将新购买回的鱼苗正常喂养一周以上,每天上午换水,早晚喂食各一次,水温保持在27℃左右。喂养期间无死亡现象,表明鱼苗无疾病隐患。试验正式开始前1d停止喂食,期间无鱼苗死亡,符合试验鱼要求。

2.3 试验步骤

正式的试验设置6个浓度组,3个平行,其中有1个为空白对照组,5个试验组。试验组TNT含量分别为(TNT溶液母液的浓度为 45.017μg◦m L-1)。设置对照组为 0μg◦ L-1(45.017μg◦m L-1×0m L);浓度 1为 2 250.85μg◦L-1(45.017μg◦m L-1×50m L);浓度 2 为 3 151.19μg◦L-1(45.017μg◦m L-1×70m L);浓度 3为 4 051.53μg◦L-1(45.017μg◦m L-1×90m L);浓度 4为4 951.87μg◦L-1(45.017μg ◦m L-1×110m L);浓度5为 5 852.21μg◦ L-1(45.017μg◦ m L-1×130m L)。

将配置好的TNT溶液加入烧杯中混匀,再随机加入10条鱼苗,24 h后对死亡鱼苗进行计数,用针刺鱼苗不活动的为死亡。

2.4 孵化致畸试验

将所购买的鱼苗,雌雄分开饲养,每天2次喂鱼,水温保持在28±1℃。光周期为 14(亮)：10(暗)。待孵化试验的前一天选取体型健康游动活泼的雄鱼5条和腹部有明显隆起的雌鱼3条,放于同一鱼缸中同时用隔板隔离,过夜,于次日早晨取出隔板,约1～2h后,去观察是否有鱼卵并收集于培养皿中冲洗干净。选取透明有双层膜的鱼卵进行下一步试验。

TNT的浓度梯度分为以下5个：(TNT溶液母液的浓度为 23.194μg◦m L-1);对照组为 0μg◦L-1(23.194μg◦m L-1×0m L);浓度1为 463.88μg◦L-1(23.194μg◦m L-1×20m L);浓度2为 927.76μg◦L-1(23.194μg◦m L-1×40m L);浓度3为1 855.52μg◦L-1(23.194μg◦m L-1×80m L);浓度 4为3 711.04μg◦L-1(23.194μg◦m L-1×160m L)。每组有3个平行,每组50枚鱼卵。鱼卵大约72h天后孵化成功。每天记录1次鱼卵发育过程中的致畸和死亡情况。

2.5 实验结果

TNT对成鱼致死的情况如图2所示。

图2 tn t对成鱼致死的情况

24h半致死浓度(LC50)根据图2可得24h半致死浓度即LC50=3 711.33μg◦L-1。孵化率和致畸情况如表3所示。

表3 不同浓度TNT 72h孵化率和致畸情况

3 结语

根据对24 h内未死的鱼苗进行观察,发现处理的第1个24h非常关键,在第1个24h未死的鱼苗,后续时间内死亡率会大幅度降低的情况,具体适应机理还不明确,仍需要从体内各种酶变化情况进行进一步研究。致畸率的结果表明三硝基甲苯能抑制斑马鱼胚胎的发育,高浓度三硝基甲苯还能引起斑马鱼幼苗畸形。由胚胎的孵化率和鱼苗的畸形率可以看出三硝基甲苯对胚胎的影响随其浓度的增高而突然加大,在三硝基甲苯浓度为463.88μg◦L-1以下时,胚胎的孵化率和畸形率上升较慢,浓度在463.88μg◦L-1到 927.76μg◦L-1之间时,平均孵化率下降15%,畸形率增加将近一倍,而浓度大于927.76μg◦L-1小于 1855.52μg◦L-1时,孵化率下降32%,畸形率增加 6倍,浓度达到 1855.52μg◦L-1时,孵化率不到一半,畸形率达到90%以上,当浓度达到3711.04μg◦L-1时胚胎出现全致死效应。这表明高浓度的TNT(大于927.76μg◦L-1)对胚胎发育毒性极大。研究表明,胚胎的毒性测试对于绝大多数化学物质的敏感度高于成鱼毒性实验[12],实验也证明了三硝基甲苯对胚胎的发育的影响较成鱼更为显著。

中国(GB4274-84)梯恩梯工业水污染物排放标准 0.5～30.0mg◦L-1(总硝基化合物,以2,4-DNT和α-DNT计)。本实验结果基本属于排放标准以内,但是如果按照标准的最高值排放,将对环境生物产生不可恢复性的影响,所以笔者认为中国梯恩梯工业水污染物排放标准上线过高,应对污染物的排放量进行更准确的规定。

致谢：感谢北京大学叶正芳教授对本文的指导。

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