日粮中等硫添加DL-蛋氨酸和蛋氨酸羟基类似物游离酸在幼建鲤上饲喂效果的比较研究

肖伟伟 冯 琳,2 刘 扬,2 姜 俊,2 姜维丹,2 胡 凯,2李树红周小秋,2*

（1.四川农业大学动物营养研究所,雅安625014;2.动物抗病营养教育部重点实验室,雅安 625014）

蛋氨酸是水生动物重要的含硫必需氨基酸,同时也是许多植物性原料的第一限制性氨基酸[1]。随着鱼粉价格不断上涨且产量达到饱和,水生动物饲料逐渐以植物蛋白替代鱼粉作为主要的蛋白质源,造成饲料中蛋氨酸普遍缺乏,补充合成蛋氨酸源成为解决此问题的重要途径[2]。DL-蛋氨酸（DLMet）和蛋氨酸羟基类似物（蛋氨酸羟基类似物游离酸是其中一种形式,英文简写为MHA-FA）是目前常见的合成蛋氨酸源,都已在陆生动物饲料中广泛使用[3]。但水生动物上关于MHA-FA的应用效果还存在争议。Keem biyehetty等[4]和Kelly[5]在条纹石鮨（Morone chrysops♀×Morone saxatilis♂）上,Goff等[6]在眼斑拟石首鱼（Sciaenops ocellatus）上的研究发现,等硫添加DL-M et和MHAFA时,MHA-FA促生长的效果显著低于DL-Met。水生动物的生长与肠道消化酶和刷状缘吸收酶活力密切相关[7],但目前还未见MHA-FA和DL-Met在水生动物肠道消化酶和刷状缘吸收酶活力上的比较研究。蛋氨酸的特殊结构与功能使其具有重要的抗氧化作用[8]。零星的研究表明,DL-Met提高条纹石鮨肝脏谷胱甘肽（GSH）含量和降低条纹石鮨肝脏丙二醛（MDA）含量的幅度明显高于等硫的MHA-FA[5,9]。但关于MHA-FA和DL-M et在水生动物多种抗氧化酶上的比较研究还未见报道。因此,本试验拟从幼建鲤（Cyprinus carpiovar.Jian）的生长性能、消化吸收和抗氧化能力方面比较MHA-FA和DL-M et的饲喂效果。

1 材料与方法

1.1试验日粮与试验设计

试验日粮以鱼粉、大米蛋白粉、棉籽粕、菜籽粕、豆粕为蛋白质源,其组成及营养水平见表1。日粮1中添加2%的DL-M et预混料（DL-Met在日粮中含量为0.52%,DL-Met纯度为98.5%,日本住友化学提供）,使日粮蛋氨酸总含量达到本课题组推荐的幼建鲤需要量[10]。日粮2中添加2%的MHAFA预混料（MHA-FA在日粮中含量为0.58%, MHA-FA纯度为88%,日本住友化学提供）,与日粮1达到等硫。原料60目粉碎,混匀后制成粒径为1.5 mm的颗粒料,自然风干备用。试验选用300尾平均体重为（8.24±0.03）g的健康幼建鲤,随机分成2组,每组3个重复,每个重复50尾,分别饲喂日粮1（DL-Met组）和日粮2（MHA-FA组）,试验期60 d。

表1 试验日粮组成及营养水平（风干基础）Tab le 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（air-d ry basis,%）

1.2饲养管理

鱼苗购回驯化30 d后开始试验,饲养于循环流水过滤水族箱（90 cm×55 cm×30 cm）中,水源为曝气自来水。水温为（25.0±1.5）℃,pH 7.0,溶氧保持在5m g/L以上。试验期间根据建鲤采食情况调整投喂量,保证每次饲喂30m in后有剩料,并迅速收集剩料,计算摄食量。

1.3 指标测定

1.3.1 生长性能

试验开始和结束时对试验鱼称重,计算增重和饲料转化率。试验前随机选取与试验鱼体重一致的30尾鱼用于鱼体蛋白质、脂肪和灰分含量测定。试验结束时,每个重复随机选取5尾鱼,经冷冻干燥后分别用凯氏定氮法、索氏抽提法和灼烧法测定鱼体蛋白质、脂肪和灰分含量,并计算蛋白质、脂肪和灰分的沉积率。计算公式为:

蛋白质（脂肪或灰分）沉积率=[（B-A）/I]×100。

其中,B为试验结束时鱼体中蛋白质（脂肪或灰分）总量（g）;A为试验开始时鱼体中蛋白质（脂肪或灰分）总量（g）;I为试验期蛋白质（脂肪或灰分）摄入总量（g）。

1.3.2 肝胰脏和肌肉谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）活力及血浆氨含量

最后1次投饲12 h后,每个重复随机选取15尾鱼,尾静脉采血并将血液置于4℃冰箱中过夜后,4℃,3 000 r/min离心10 min。取血清按测定各指标所需要的样品量进行分装,然后置于-20℃冰箱中冷冻保存备用。同时取肝胰脏、肠道和肌肉用液氮冷冻后在-70℃冰箱保存备测。肝胰脏和肌肉GOT、GPT活力用试剂盒测定（南京建成生物工程研究所）。最后1次投饲6 h后,每个重复随机选取5尾鱼,乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝针管尾部血管采血,两点法测定血浆氨含量（中生北控测试盒）,2 h内完成。

1.3.3 消化吸收指标

肝胰脏和肠道糜蛋白酶、胰蛋白酶活力测定参照Hummel[11]的方法进行。肝胰脏和肠道脂肪酶和淀粉酶活力测定参照Furne等[12]的方法进行。全肠肌酸激酶（CK）和各肠段碱性磷酸酶（AKP）、Na+,K+-ATP酶活力的测定分别参照W eng等[13]、K rogdah l等[14]、Ilenchuk等[15]的方法进行。各肠段γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）活力用试剂盒测定（南京建成生物工程研究所）,具体按试剂盒说明书进行。

1.3.4 抗氧化指标

血清、肠道和肝胰脏的MDA含量测定参照Lingstone等[16]的方法,超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的测定参照Zhang等[17]的方法,过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、GSH和谷胱甘肽硫转移酶（GST）活力的测定分别参照Aebi[18]、Lora等[19]和Lushchak等[20]的方法。

1.4 统计分析

采用SPSS 11.5对试验数据进行t检验,结果以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1生长性能

由表2可知,MHA-FA组幼建鲤的末重、增重、饲料转化率以及蛋白质、脂肪和灰分的沉积率与DL-Met组均差异不显著（P＞0.05）,但摄食量显著低于DL-Met组（P＜0.05）。

表2 等硫添加DL-Met和M HA-FA对幼建鲤生长性能的影响Table 2 Effects of equal-sulfur supp lementation with DL-Met and MHA-FA on grow th perform ance of juvenile Jian carp

2.2 肌肉和肝胰脏GPT、GOT活力以及血浆氨含量

由表3可知,MHA-FA组幼建鲤的肝胰脏GOT、肌肉和肝胰脏GPT活力以及血浆氨含量与DL-Met组均差异不显著（P＞0.05）,但肌肉GOT活力显著低于DL-M et组（P＜0.05）。

表3 等硫添加DL-M et和MHA-FA对幼建鲤肌肉和肝胰脏GPT、GOT活力以及血浆氨含量的影响Tab le 3 Ef fects of equal-sulfur supp lem entation w ith DL-M et and MHA-FA on GPT and GOT activities in muscle and hepatopancreas and p lasma ammonia content of juvenile Jian carp（U/g）

2.3消化吸收指标

由表4可知,MHA-FA组的肝胰脏和肠道胰蛋白酶、糜蛋白酶以及肠道脂肪酶和淀粉酶活力与DL-Met组均差异不显著（P＞0.05）,但肝胰脏脂肪酶和淀粉酶活力显著低于DL-Met组（P＜0.05）。

表4 等硫添加DL-M et和MHA-FA对幼建鲤肠道和肝胰脏消化酶活力的影响Table 4 Ef fects of equal-sulfur supp lementation w ith DL-Met and MHA-FA on digestive enzyme activities in intestine and hepatopancreas of juvenile Jian carp（U/g）

由表5可知,MHA-FA组的前肠和中肠AKP、各肠段Na+,K+-ATP酶、中肠γ-GT以及全肠CK活力与DL-M et组均差异不显著（P＞0.05）,但后肠AKP、前肠和后肠γ-GT活力显著低于DL-M et组（P＜0.05）。

2.4 抗氧化指标

由表6可知,MHA-FA组的血清、肠道和肝胰脏MDA含量显著高于DL-Met组（P＜0.05）。 MHA-FA组的肝胰脏和肠道GSH活力与DL-Met组差异不显著（P＞0.05）,但血清GSH活力显著低于DL-Met组（P＜0.05）。MHA-FA组的血清、肝胰脏和肠道SOD、GR活力与DL-Met组无显著差异（P＞0.05）。MHA-FA组的血清和肠道CAT以及肠道和肝胰脏GST、GSH-Px活力显著低于DLM et组（P＜0.05）,而肝胰脏CAT,血清GSH-Px、GST活力与DL-Met组无显著差异（P＞0.05）。

表5 等硫添加DL-Met和MHA-FA对幼建鲤肠道吸收酶活力的影响Tab le 5 Effects of equal-sulfur supplementation w ith DL-Met and MHA-FA on absorptive enzyme activities in intestine of juvenile Jian carp（U/g）

表6 等硫添加DL-M et和MHA-FA对幼建鲤血清、肠道和肝胰脏抗氧化指标的影响Table 6 Ef fec ts of equal-su lfur supp lementation w ith DL-Met and MHA-FA on antioxidation indices in the serum,intestine and hepatopancreas of juvenile Jian carp（U/mg prot）

3 讨 论

3.1 等硫添加DL-Met和MHA-FA对幼建鲤生长性能的影响

蛋氨酸是鲤鱼重要的含硫必需氨基酸,植物蛋白日粮中补充蛋氨酸可以促进鲤鱼的生长[21-22]。在本试验日粮中补充等硫水平的DL-M et和MHAFA并达到幼建鲤的蛋氨酸需要量,结果发现增重二者差异不显著。这与Keembiyehetty等[4]和Kelly[5]在条纹石鮨及Gof f等[6]在眼斑拟石首鱼上的研究得出的DL-M et的增重效果显著高于等硫的MHA-FA的结果不一致。结果不太一致的原因可能有:1）水生动物品种不同。MHA-FA进入机体需要经L-2-羟基酸氧化酶和D-2-羟基酸脱氢酶转化为2-酮-4-甲硫基丁酸,再由转氨酶转化为L-蛋氨酸才能被机体利用[23]。建鲤转化并利用MHA-FA的能力可能高于其他水生动物。2）日粮类型不同。本试验中采用实用日粮,以上研究均采用纯合或半纯合日粮。Gutteridge等[24]和Daenner等[25]在肉鸡上的研究发现,实用日粮下等硫的MHA-FA与DL-M et的增重效果相当。

摄食量和饲料转化率是影响水生动物生长的2个重要因素,而体沉积的变化在一定程度上反映了动物对饲料的利用效率。本试验结果显示,MHAFA组的幼建鲤摄食量显著低于DL-Met组,但蛋白质、脂肪和灰分的沉积率2组差异不显著,二者的饲料转化率也相当。这表明,幼建鲤利用含等硫的MHA-FA和DL-Met饲料的效率是一样的。蛋白质沉积率与机体的氨氮代谢以及体蛋白质合成的能力有关[26]。肝胰脏和肌肉是体内蛋白质代谢的主要场所,而GOT和GPT是2种主要参与氨基酸代谢的酶,其活力高低可以反映体内氨基酸被利用的情况[27]。氨是鱼类蛋白质在肝脏和肾脏分解代谢的主要终产物,血浆氨含量与日粮氨基酸含量及比例有关[28]。本研究发现,等硫的MHA-FA和DLMet组的幼建鲤的肌肉、肝胰脏中GOT和GPT活力以及血浆氨含量无显著差异。这表明,等硫的MHA-FA和DL-Met调节氨基酸的周转代谢和蛋白质合成的效率几乎相当,表现出体蛋白质沉积的效果也一样。

3.2 等硫添加DL-M et和MHA-FA对幼建鲤消化酶和吸收酶活力的影响

水生动物的生长来源于对营养物质充分的消化吸收,营养物质的消化以酶消化为主,吸收靠多种吸收酶完成,因此生长与消化酶和吸收酶的活力密切相关[8]。本研究发现,MHA-FA组的肝胰脏和肠道胰蛋白酶、糜蛋白酶以及肠道脂肪酶和淀粉酶活力与DL-Met组差异不显著,但肝胰脏脂肪酶和淀粉酶活力显著低于DL-M et组。这表明,DL-Met可能更有利于脂肪酶和淀粉酶的分泌,但由于肠道消化酶活力大多与等硫的MHA-FA相当,二者在消化能力上几乎可达到相同的效果。

Na+,K+-ATP酶是存在于多种生物膜上的一种蛋白酶,参与多种氨基酸的转运过程[29],其活力间接反映肠道的吸收能力。由本研究结果可知,投饲等硫的MHA-FA和DL-Met饲料的幼建鲤的各肠段Na+,K+-ATP酶活力差异均不显著。γ-GT是谷氨酸循环的关键酶,可促进氨基酸向细胞内转运,为蛋白质生物合成提供原料[30]。本研究发现, MHA-FA组的中肠γ-GT活力与DL-M et组差异不显著,但前肠和后肠γ-GT活力显著低于DLM et组。肠道AKP分布在肠上皮刷状缘细胞表面,与脂类、氨基酸、葡萄糖等多种物质的吸收有关,也反映肠上皮细胞的吸收能力[31]。本研究显示, MHA-FA组的前肠和中肠AKP活力与DL-Met组无显著差异,但后肠AKP活力显著低于DL-Met组。CK在能量代谢中扮演重要角色,参与多种酶与ATP的组装过程,为肠道营养物质的吸收提供能量。本研究发现,投饲等硫的MHA-FA和DL-Met饲料的幼建鲤整个肠道CK活力差异不显著。以上结果表明,等硫添加MHA-FA和DL-M et时,幼建鲤的绝大部分肠道吸收酶活力相当。

3.3 等硫添加DL-Met和MHA-FA对幼建鲤抗氧化能力的影响

蛋氨酸代谢生成的Cys可参与抗氧化物质GSH和牛磺酸的合成[2,32],且其本身的巯基具有氧化还原的特点[33],使其在机体抗氧化系统中发挥着重要作用。体内脂质中的多不饱和脂肪酸易受活力氧物质（ROS）攻击发生氧化而生成终产物MDA,因此MDA含量常用来反映体内脂质过氧化的程度[34]。本研究结果显示,DL-M et组的血清、肠道和肝胰脏MDA含量显著低于MHA-FA组,这与Li等[9]在条纹石鮨上的研究结果一致。这表明,补充DL-Met的水生动物体内脂质过氧化的程度小于等硫的MHA-FA。正常情况下,体内抗氧化系统使体内ROS的产生和清除处于动态平衡,维持在适宜水平而不会造成机体的氧化损伤。SOD主要负责清除超氧阴离子（O2-）,将其转化为H2O2;CAT和GSH-Px作为SOD的下游酶类,分别在微粒体和胞浆、线粒体基质中清除H2O2,同时GSH-Px还具有清除脂质过氧化产物的能力[35];GR主要负责将氧化型谷胱甘肽转化为GSH,维持体内GSH的平衡;GSH作为体内重要的抗氧化物质,可以直接还原H2O2和过氧化脂质,还参与了维生素C的再生过程;GST的同工酶能够将脂质过氧化产物清除出细胞[36]。由本试验结果可知,MHA-FA组的血清、肠道和肝胰脏SOD、GR,肠道和肝胰脏GSH、肝胰脏CAT及血清GSH-Px和GST活力与DL-Met组差异不显著,但血清GSH、血清和肠道CAT、肠道和肝胰脏GST、GSH-Px活力显著低于DL-Met组。上述结果表明DL-M et组的多种抗氧化酶活力高于等硫的MHA-FA组,这可能是其血清、肠道和肝胰脏MDA含量较低的主要原因。DL-Met的抗氧化能力在一定程度上优于等硫的MHA-FA,可能是二者在体内参与的代谢有所不同,还有待进一步研究。

4 结 论

①在本试验日粮中添加的MHA-FA能够很好地被幼建鲤吸收利用。

②在生长性能方面,等硫的MHA-FA可以完全替代DL-M et;在消化吸收和抗氧化能力方面,等硫的MHA-FA可以部分替代DL-Met。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:Zhouxq@sicua.edu.cn

（编辑 菅景颖）