母种猪饲粮添加DL-硒代蛋氨酸对后代乳猪胰脏硒含量、抗氧化能力、消化酶活性以及GSH-PxmRNA表达的影响

胡 鹏 占秀安* 郄彦昭 王永侠 赵茹茜

（1.浙江大学饲料科学研究所,杭州 310029;2.南京农业大学,农业部动物生理生化重点实验室,南京 210095）

硒是动物必需的微量元素之一,硒能参与机体谷胱甘肽过氧化物酶的合成,保持动物机体健康,保护胰脏,从而维持胰脏正常功能,促进消化酶分泌,促进畜禽生长。硒有无机硒和有机硒2种形式,与无机硒相比,有机硒在动物体内具有吸收率高、生物活性强、毒性低、环境污染小等特点[1-2]。因此,近年来有机硒替代无机硒成为研究热点。Mahan等[3]报道,酵母硒可增加组织硒浓度,有助于维持组织细胞的完整性,减少猪肉的滴水损失。Danny[4]认为以酵母硒的形式向母猪饲粮中添加的有机硒,有机硒的生物利用率高于以亚硒酸钠形式提供的无机硒。而酵母硒的主要成分是DL-硒代蛋氨酸。现阶段国内对有机硒的研究也很多,但关于母猪饲喂DL-硒代蛋氨酸后对后代乳猪胰脏功能的影响则未见报道。为了解DL-硒代蛋氨酸对“长×大”母猪后代胰脏功能的影响,本试验以高纯度DL-硒代蛋氨酸作为有机硒源,亚硒酸钠为对照,研究了母种猪饲粮中添加不同硒源对后代乳猪胰脏组织硒沉积、抗氧化能力、消化酶分泌以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）基因表达的影响,旨在探讨DL-硒代蛋氨酸对母种猪传代效应的应用效果,并为其推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DL-硒代蛋氨酸（纯度99.5%）,亚硒酸钠（纯度98.0%）,由Sigm a公司提供。

1.2 试验动物及饲粮

试验选用浙江嘉兴欣欣养殖场提供的“长×大”母猪,试验饲粮为参照NRC（1998）妊娠期和泌乳期母猪营养需要配合而成的颗粒状饲料,其饲粮组成和营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Tab le 1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-d ry basis）%

1.3 试验设计与饲养管理

选择妊娠后期、胎次相同的“长×大”母猪12头,随机分为2组,分别设为亚硒酸钠组（sodium selenite group）和DL-硒代蛋氨酸组（DL-selenom ethionine group）,在基础饲粮中（硒的实测值为0.04 mg/kg）添加亚硒酸钠和DL-硒代蛋氨酸各0.3 mg/kg,每组6个重复,每重复1头。试验分妊娠后期（32 d）和泌乳期（28 d）2个阶段,共60 d,分别饲喂妊娠期和泌乳期饲粮。试验母猪每天于06:00、12:00和17:00饲喂3次,妊娠后期每次每头喂料1.3 kg,泌乳期每次每头喂料2.0 kg。自由饮水,保持产房清洁、通风。乳猪喂乳不喂料直至断奶。

1.4 样品采集与保存

饲养试验结束后,每个重复选取体重相近（约7 kg）的乳猪（母）1头,共12头,进行屠宰。宰前禁饲24 h,自由饮水。常规屠宰,分离胰脏并称重,置于-70℃冰箱中保存。

1.5 指标测定及方法

1.5.1 乳猪胰脏指数

胰脏指数（%）=（胰脏重/宰前活猪重）×100。

1.5.2 乳猪胰脏硒含量测定

称取0.2 g左右样品于微波消解罐中,加入1m L过氧化氢,拧紧罐盖,于微波消解系统内消解7m in左右,消解至无色透明液,冷却后取出用超纯水定容至10m L,取过滤消化液2 m L于10m L试管中,加体积分数为50%的盐酸溶液1 m L,加入5%硫脲和5%抗坏血酸的混合液1 m L,反应15 m in后用超纯水定容,混匀,于AFS-230a双道原子荧光光度计上机测定,同样方法做空白对照。

1.5.3 乳猪胰脏抗氧化指标测定

GSH-Px、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）采用试剂盒测定,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 乳猪胰脏消化酶测定

样品处理:称取0.2 g左右胰脏,加4.0m L生理盐水,匀浆,4℃放置24 h,5 000 r/min离心15 m in。取一部分上清液直接用于测定胰蛋白酶（LPS）、淀粉酶（AMS）和脂肪酶（TPS）活性。胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性采用试剂盒方法测定,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5.5 胰脏中GSH-Px mRNA表达量的测定

取乳猪胰脏组织后,立即按照Trizo l试剂（Invtrogen公司）的说明书提取总RNA,测定RNA的纯度及含量,然后对GSH-Px进行逆转录反应。取总RNA 2μg,按BBI公司MM LV Reverse Transcrip tase cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA, -20℃保存。根据试剂说明书配制RT-PCR反应液,将反应液置于荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）上进行定量PCR扩增反应。GSH-Px基因（登录号:NM_214201）和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因（登录号:AF017079）采用Primer exp ress 2.0和Beacon designer荧光引物设计软件设计引物,引物由上海生物工程有限公司合成,序列见表2。RT-PCR使用的预变性条件为:95℃预变性,10 s;45个循环分别经历了3个过程（95℃变性,5 s;60℃退火/延伸,25 s）。用比较模板的域值循环数（Ct）相对定量法研究乳猪胰脏组织中GSH-Px基因表达。以内参基因GAPDH为参比,则Ct的相对量为△Ct=Ct（目的基因）-Ct（GAPDH）。 GSH-Px基因相对表达水平以2-△△Ct表示。

表2 GSH-Px和GAPDH基因引物序列Table 2 Primer sequence of genes for GSH-Px and GAPDH

1.6 数据处理

用SPSS 16.0软件进行统计分析,数据以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 胰脏指数、硒含量和抗氧化指标

由图1可见,母种猪饲喂DL-硒代蛋氨酸后,后代乳猪胰脏指数有提高趋势（P＞0.05）,胰脏组织硒含量也提高了54.29%（P＜0.01）。

图1 母种猪补充不同硒源对后代乳猪胰脏指数和胰脏硒含量的影响Fig.1 Effects of adding dif ferent Se sources to the sow diet on pancreas index and Se content in pancreas o f suck ling pigs（n=6）

由表3可见,与亚硒酸钠组比,母种猪饲粮中添加DL-硒代蛋氨酸使后代乳猪胰脏T-AOC提高了112.52%（P＜0.01）;GSH-Px活性提高了22.84%（P＜0.01）;SOD活性提高了24.60%（P＜0.01）;GSH含量提高了131.14%（P＜0.01）; MDA含量降低了25.55%（P＜0.01）。

2.2 乳猪胰脏组织消化酶活性

表4表明,与亚硒酸钠组相比,母猪饲粮添加DL-硒代蛋氨酸使后代乳猪胰脏中淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性分别提高了50.81%（P＜0.01）、17.61%（P＜0.05）和14.87%（P＜0.05）。

2.3 乳猪胰脏组织GSH-Px mRNA的表达

GAPDH引物和GSH-Px引物的溶解曲线引物扩增均具有单一的熔点曲线峰图,说明二者均具有较强的特异性。GAPDH m RNA及GSH-Px m RNA扩增S形曲线很好,检测到的荧光信号也高,说明该方法可以对本试验中的阳性模板进行高效扩增,从而进行准确定量。以不同梯度定量模板数的对数值为横坐标,Ct值为纵坐标建立标准曲线,结果表明,胰脏组织中GAPDH m RNA和GSH-Px m RNA表达的RT-PCR检测标准曲线表明不同梯度定量模板数的对数值与Ct值之间存在较好的相关关系,其相关系数均在0.996以上。随后计算目的基因GSH-Px相对于内参基因GAPDH的△△Ct值,并计算GSH-Px基因相对表达量,结果如图2,以GAPDH为内参,2-△△Ct值为1.31＞1,表明DL-硒代蛋氨酸处理后,GSH-Px m RNA的表达有所上调且差异显著（P＜0.01）。

表3 母种猪补充不同硒源对后代乳猪胰脏抗氧化指标的影响Tab le 3 Effects o f adding different Se sources to the sow diet on antioxidant indices in pancreas of suck ling pigs（n=6）

表4 母种猪补充不同硒源对后代乳猪胰脏消化酶活性的影响Table 4 Effects o f adding different selenium sources to the sow diet on pancreas digestive enzyme activities of sucking pigs（n=6）

图2 母种猪补充不同硒源对后代乳猪胰脏组织GSH-PxmRNA表达量的影响Fig.2 Effects of adding different Se sources to the sow diet on pancreas GSH-Pxm RNA level in sucking pigs（n=6）

3 讨 论

3.1 母种猪补充不同硒源对后代乳猪胰脏指数、硒含量和抗氧化指标的影响

本试验研究发现,妊娠后期母种猪补充DL-硒代蛋氨酸至28 d断奶较亚硒酸钠,显著提高了后代乳猪胰脏组织硒含量,这与M ahan等[5-6]和Kim等[7]的研究结果基本一致,且胰脏指数也有提高趋势。血液中GSH-Px及SOD活性、MDA含量、TAOC是反映机体抗氧化能力的重要指标[8]。本研究表明,母种猪饲粮中添加DL-硒代蛋氨酸相对于亚硒酸钠显著提高了后代乳猪胰脏中T-AOC、GSH-Px活性、SOD活性和GSH水平,降低了MDA含量,这说明DL-硒代蛋氨酸相对于亚硒酸纳可以明显提高后代乳猪的抗氧化能力,推测这可能由有机硒和无机硒的代谢途径不同所导致的结果,无机硒在动物肠道中是被动吸收的,有机硒则是以氨基酸的运输机制主动吸收,有机硒使总硒的贮存量增加,为硒在组织中的贮存提供了一个硒库。无机硒的代谢通路中,仅有很少量的无机硒结合进入体蛋白,大多数未能用于合成硒蛋白的硒进入肾脏,最终排出体外[9-10]。

3.2 母种猪补充不同硒源对后代乳猪胰脏组织消化酶活性的影响

胰脏具有内分泌和外分泌的功能,内分泌主要分泌胰岛素、胰高血糖素和补体素,外分泌主要分泌胰淀粉酶、胃蛋白酶及胰凝蛋白酶、脂肪酶和胰脏核酸酶。消化酶活性是反映机体消化生理机能的一项重要指标,直接影响蛋白质、脂肪等营养物质的消化吸收。张桂珍等[11]研究表明,在克山病区饲粮中补充一定剂量硒可明显提高大鼠血清淀粉酶与脂肪酶活性,增加胰腺腺泡淀粉酶与脂肪酶的合成。郭孝等[12]给W istar大白鼠饲粮添加高硒钴苜蓿青草粉后,能够显著增强大白鼠的胃蛋白酶活性,减少饲粮在胃内的残留率,提高饲粮在小肠内的推进率。这说明硒能提高哺乳动物消化酶活性,改善饲料转化效率和生长性能。本试验饲粮添加DL-硒代蛋氨酸后使后代乳猪相对对照组淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性显著提高,进而推测有机硒相对无机硒更能促进后代乳猪胰脏内分泌的调节,促进胰脏消化酶的分泌,从而促进生长。

3.3 母种猪补充不同硒源对后代乳猪胰脏组织GSH-PxmRNA表达的影响

前已述及,母种猪补充DL-硒代蛋氨酸较亚硒酸钠显著提高了后代乳猪胰脏中的GSH-Px活性。由于硒是GSH-Px中的重要成分,它催化过氧化物还原[13],因此硒与GSH-Px含量呈正相关。而本试验已证实,饲喂DL-硒代蛋氨酸较亚硒酸钠显著地提高了后代乳猪胰脏中的硒含量,从而推测DL-硒代蛋氨酸组胰脏组织GSH-Px活性可能会高于亚硒酸钠组,但尚未从基因表达水平对其进行确证,又因为硒与胰脏的关系密切,且氧化应激是缺硒损害动物组织的病理学基础。因此,检测胰脏中的GSH-Px mRNA具有重要意义。Qin等[14]报道,小鼠饲粮中添加0.1 mg/kg硒水平的亚硒酸钠和酵母硒,酵母硒组小鼠血清GSH-Px活性显著高于亚硒酸钠组,小鼠肝脏GSH-Pxm RNA丰度值也表现出一致的规律性。本试验首次研究表明,母种猪饲粮添加DL-硒代蛋氨酸同比亚硒酸钠显著提高了后代乳猪胰脏组织GSH-Px m RNA表达。

4 结 论

在本试验条件下,母种猪饲粮中补充同一水平（0.3 m g/kg）的DL-硒代蛋氨酸较亚硒酸钠可显著提高后代乳猪胰脏组织硒含量（P＜0.01）、抗氧化能力（P＜0.01）、消化酶活性（P＜0.05,P＜0.01）、GSH-Px m RNA表达量（P＜0.01）。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:xazan@zju.edu.cn

（编辑 武海龙）