脂肪源性间充质干细胞与肝病

陈耀凯 郭 艳

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有高增殖活性与多向分化潜能等干细胞特性，可在体外扩增分化成为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞及肝细胞等成体细胞。间充质干细胞来源广泛，存在于骨髓、脐带血、脂肪、滑膜、骨骼肌、肝脏、胰腺和血管等多种组织或器官中，不同来源的MSCs在生物学特性上无显著差异。骨髓源性间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BDMSCs）一直是干细胞领域的研究重点，但BDMSCs来源困难、取材不易，使其应用前景受限。相对于BDMSCs而言，脂肪源性间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）来源丰富，取材容易，具有自我更新、多向分化和高增殖特性等重要干细胞特征，可望成为细胞工程和组织工程理想的种子细胞来源，已受到广泛关注。

一、ADMSCs的生物学特性

2001年，Zuk等[1]首次从人类皮下脂肪组织中分离出一种多能干细胞，该细胞形成的克隆具有自我更新能力并可分化为多种组织，此即ADMSCs。ADMSCs与BDMSCs形态学特征极为相似。细胞于接种12～24h后完全贴壁，细胞呈圆球形、纺锤形或梭形，细胞核居中，可见双核或多核。随传代次数增加，圆球形细胞逐渐减少，细胞形态以纺锤形或梭形为主。

有关ADMSCs特异性表面标志至今仍无统一认识，不同实验室研究结果不尽相同，这种差异可能与细胞分离、培养和纯化方法存在差异有关。Zuk等[2]研究发现ADMSCs表达CD13 而不表达 CD14、CD16、CD56、CD61、CD62E、CD104 和CD106。Gronthos等[3]通过流式细胞仪和免疫组化分析发现，ADMSCs蛋白质表达与BDMSCs非常相似，可表达CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD59、CD105、CD106、CD146 及 CD166。但与 BDMSCs不同的是，ADMSCs不表达Stro-1抗原。Rodriguez等[4]研究发现，ADMSCs表达 CD44、CD105、CD49b、CD90 和 CD13 而不表达Stro-1、CD34、CD15、CD117、Flk-1、gly-A、CD133 和 HLR-DR。

在体内外特定诱导条件下，ADMSCs可分化形成多种细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞、胰腺内分泌细胞等。体外培养中，ADMSCs倍增时间一般为2～4天[5]。细胞传代相对稳定、增殖旺盛，体外培养10代以后，细胞增殖速度仍无明显减慢。传代过程中端粒长度保持稳定，但端粒酶活性变化趋势尚不肯定，有研究显示端粒酶活性基本保持不变，但也有研究显示端粒酶活性可能降低或消失[5]。

二、ADMSCs的多向分化潜能

与其他MSCs相似，ADMSCs在体外试验中可诱导分化成为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞及肝细胞等成体细胞。

（一）分化为脂肪细胞 王乐禹等[6]采用传代培养2～4代的ADMSCs，在含胎牛血清、青链霉素原液、地塞米松、胰岛素和LIBMX的高糖DMEM培养基中诱导培养1周，结果细胞内出现大量脂滴，油红“O”染色可见胞浆内有大量红染颗粒，表明ADMSCs在特定条件下分化成为脂肪细胞。Dicker等[7]发现ADMSCs可表达成熟脂肪细胞的某些重要特征，在邻苯二酚胺的刺激下表现出脂解能力，在α2-肾上腺素受体的介导下可表现出抗脂解活性且可分泌一些典型的脂肪细胞因子，如脂联素、瘦素等。而且，ADMSCs在多次传代后仍保持向脂肪细胞的分化能力。

（二）分化为成骨细胞 鞠晓东等[8]研究证实在呋塞米、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠的共同诱导下，ADMSCs碱性磷酸酶表达量增加，细胞基质发生钙化，骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）开始大量表达，表明其可分化为成骨细胞。ADMSCs向成骨细胞的分化过程受多种因子的调节，如Hattori等[9]研究发现BMP-2可上调Runx-2和骨桥蛋白基因的表达，促进ADMSCs的成骨性分化。制瘤素（oncostatin M，OSM）可通过诱导碱性磷酸酶、Runx-2和骨钙素的表达及增加细胞基质钙化而促进ADMSCs向成骨细胞分化[10]。相反，成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）则可抑制ADMSCs向成骨细胞分化[11]。

（三）分化为软骨细胞 有研究显示，在含有转化生长因子-1、胰岛素和转铁蛋白的特定培养基诱导下，ADMSCs可向软骨细胞分化，诱导后细胞表达前II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因。FGF-2可通过诱导N-钙粘蛋白、转录因子Sox-9的表达而促进ADMSCs向软骨分化[12]。

（四）分化为心肌细胞 Rangappa等[13]采用5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）在体外培养过程中诱导ADMSCs定向分化为心肌细胞，3周时可观察到细胞出现自发搏动并可表达 α 肌动蛋白（α-actin）、心肌肌钙蛋白 I（C-TnI）等心肌细胞特异性标志，研究者认为ADMSCs可望成为心肌细胞移植的细胞来源之一。

（五）分化为血管内皮细胞 ADMSCs具有向血管内皮细胞分化的能力，诱导分化的血管内皮细胞可分泌部分促血管生成因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等。管利东等[14]利用脂肪抽提术从脂肪组织中分离出ADMSCs，将其在含有马血清、地塞米松、尼克酰胺、VEGF和FGF等的DMEM培养液中诱导培养，结果诱导后细胞具有血管内皮细胞的一些特性，能够表达血管内皮细胞特异性表面标志CD34和vWF，具有很强的低密度脂蛋白摄取和前列环素代谢活力，并且在Matrigel凝胶中能够形成毛细血管样结构。

（六）分化为神经细胞 ADMSCs虽起源于中胚层，但可横向分化为外胚层来源的神经细胞。周进等[15]用含有丁酸酯羟基茴香醚、KCL、丙戊酸、地塞米松和胰岛素的培养液，诱导ADMSCs向神经细胞分化。诱导后细胞出现类似轴突和树突样结构，有类神经元间网络形成，表达神经元特异性烯醇化酶。

（七）分化为胰腺内分泌细胞 Timper等[16]在activin-A、exendin-4、HGF及五肽胃泌素的诱导下，成功将人类ADMSCs分化成具有胰腺内分泌表型的细胞。这些分化细胞表达Isl-1、Pax-6、Ipf-1、Ngn-3及胰腺内分泌激素，如胰岛素、胰高血糖素和生长抑素。

三、ADMSCs在肝脏疾病中的应用

在特定体外诱导条件下，ADMSCs具有向肝细胞分化的能力。Seo等[17]研究发现在HGF、OSM及二甲基亚砜（DMSO）的诱导下，ADMSCs逐渐向肝细胞分化，分化细胞表达白蛋白（ALB）和甲胎蛋白（AFP）等肝细胞表型，且具有摄取低密度脂蛋白及尿素合成功能。Banas等[18]研究发现，在HGF和FGF（FGF-1，FGF-4）的诱导下，来自于不同年龄患者的ADMSCs均可诱导为肝细胞样细胞，这些细胞能够表达多种肝特异性标志及功能，如白蛋白合成、低密度脂蛋白摄取和氨代谢功能等。Yamamoto等[19]通过聚类分析发现由ADMSCs分化而来的肝细胞和正常肝细胞在基因表达方面极为相似，表明ADMSCs经特定诱导后可在基因水平上表达肝细胞的某些特征。

Banas等[20]最近研究发现，将ADMSCs移植到CCl4诱导肝损伤的裸鼠体内，移植后受体裸鼠体内血氨、尿酸、ALT及AST水平逐渐趋于正常，表明植入裸鼠体内的ADMSCs对受损肝脏产生了明显修复作用。他们还比较了ADMSCs、BDMSCs 及 NHDFs（normal human dermal fibroblasts，正常人皮肤成纤维细胞）诱导为肝细胞后在体外产生细胞因子和生长因子的能力，结果发现ADMSCs诱导的肝细胞在IL-1Rα、IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MCP-1、NGF 和 HGF 的分泌量上要高于后两者来源的肝细胞。IL-6是肝脏再生转录因子的关键诱导因子，是启动肝细胞再生早期信号转导机制中不可缺少的重要组成部分。HGF能显著促进肝细胞再生，有利于肝细胞膜稳定性及肝功能恢复，促进血管内皮细胞生长和毛细血管再生。因此，作者认为ADMSCs在促进肝再生方面可能较BDMSCs更加有利。柳林等[21]经肝动脉途径移植自体ADMSCs治疗肝硬化患者8例，并与采用内科综合疗法的10例肝硬化患者进行对照研究。结果发现治疗组血清ALT、ALB和PTA等肝功能指标的变化优于对照组，差异有统计学意义。研究者认为经肝动脉途径移植自体ADMSCs治疗晚期肝病短期疗效确切。Vilalta等[22]研究发现，人类ADMSCs移植入人体后，细胞增殖状态稳定，且移植后8个月内并未发现受体组织发生染色体异常及肿瘤形成。研究者认为ADMSCs移植可作为一种新型治疗方法用于临床治疗终末期肝脏疾病，且肝脏是ADMSCs体内定植的首选器官。

有关ADMSCs的研究还发现一个有趣的现象，即ADMSCs对原位肝移植后排斥反应的发生有一定抑制作用，具体机制尚未完全明了，可能是因为ADMSCs干扰了树突状细胞、T淋巴细胞或NK细胞的功能而发挥免疫调节作用[23]。Wan等[24]新近研究发现，移植的ADMSCs可明显抑制受体源性T淋巴细胞增殖，并且可显著减轻原位肝移植大鼠模型急性排斥反应的发生率及严重程度。免疫抑制剂他克莫司（Tacrolimus）治疗慢性肝移植物抗宿主病（GVHD）可导致进行性肾功能损害，Fang等[25]对此类患者采取停用他克莫司给予ADMSCs移植治疗，结果GVHD很快得到缓解，肾脏功能也有所改善，表明ADMSCs有可能作为一种临床治疗器官移植排斥反应的新方法。

四、小结与展望

综上所述，ADMSCs具有强大增殖能力和多向分化潜能，有可能成为多种疾病治疗的细胞来源，但ADMSCs研究时间较短，因而研究深度不及其他类型的MSCs，诸如ADMSCs分离培养、诱导分化及安全性等均有待进一步深入研究。今后的研究可能集中于以下几个方面：（1）确定ADMSCs特异性细胞标记，并在此基础上建立稳定的分离与纯化方法；（2）基于不同分化方向建立不同的诱导分化方法，并尽量使之标准化、高效化；（3）致瘤性风险是制约干细胞临床应用的重要因素，ADMSCs亦不例外，因此对于其安全性的评价也将是一个重要研究方向。

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