三种检测乙型肝炎病毒YMDD自然变异方法的比较

闵晓春 赵书民 杨德刚

生物变异是自然界普遍存在的现象，乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）复制活跃，且 HBV DNA聚合酶逆转录功能区不具备校正功能，因而具有更高的基因突变率，约为10-5核苷酸替换/位点/年[1]。对于未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者，HBV在慢性持续感染过程中将可能出现自然变异。近年来国内外学者采用了各种YMDD变异检测方法，对未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者血清进行检测，均发现体内有着较高的YMDD自然变异株[2-4]。对于YMDD变异株相对较少的YMDD自然变异的慢性HBV患者来讲，目前许多检测方法仍存在一定的局限性。因此，确定一种特异性及灵敏性较高的检测方法将具有重要意义。本研究选用临床上常用的PCR产物直接测序法、单探针特异性荧光PCR技术及引物特异性荧光PCR技术进行比较，以确定一种临床上更具优势的检测YMDD自然变异的检测方法。

资料与方法

一、YMDD、YVDD、YIDD质粒（以下分别简称M、V、I质粒）的构建 构建质粒所设计引物：Y3U（上游引 物） 5’-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3’（652-668），Y3D（下游引物） 5’-GGCAGGATAGCCACATT-3’（1052-1036），以YMDD、YVDD和YIDD阳性血清为模板（取自上海长征医院感染科血清库，对象均为慢性乙型肝炎患者，用S区引物荧光PCR法检测HBV DNA均为107拷贝/ml，用包含YMDD的P基因片段的引物进行PCR扩增，PCR产物经上海生工公司测序为 YMDD、YVDD和 YIDD变异），PCR扩增包含YMDD的P基因片段，PCR产物经纯化、连接、转化、质粒提取（按试剂盒说明操作，试剂盒购自TaKaRa及上海华美生物公司），质粒经HindHI、EcoRI酶切鉴定，以M13（-）引物测序（上海生工生物公司）。

二、质粒浓度的定量 抽提质粒M、质粒I、质粒V用紫外分光光度计进行定量，根据公式换算成拷贝数；并予HBV DNA荧光定量PCR法检测以进一步验证。获得质粒标准品依次梯度稀释后供下一步实验使用。

三、不同比例混合的质粒的直接测序 取I质粒和 V 质粒各 100μl，分别按 1：1、1：1.5、1：2、1：3、1：4、1.5：1、2：1、3：1、4：1 比例混合，各取混合液 10μl进行测序。测序结果依据图型文件的比较进行判定，序列比较采用Vector NTI Suite 7.0软件包中的AlignX模块完成。

四、单探针特异性荧光PCR技术的检验 将构建的M质粒与I质粒（分别配制成1×108copies/ml、1×107copies/ml、1×106copies/ml的质粒溶液），按 10：1、2：1、1：1、1：2、1：5、1：10、1：50、1：100 混合，取混合液作为扩增模板（YMDD变异检测试剂盒购自杭州博赛基因诊断技术有限公司）。判定标准：待测样品在检测液A和检测液B的荧光检测Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数）均≤38时，该样品为HBV YMDD野生型；当检测液A的荧光检测Ct值≤38，检测液B的荧光检测Ct值＞38，则该样品为HBV YMDD变异型。

五、引物特异性荧光PCR技术的检验 以梯度稀释的 V 质粒、M 质粒、I质粒（均为 1×108copies/ml）为模板，采用引物特异性荧光PCR法进行检测。（YMDD变异检测试剂盒购自上海复星医学科技发展有限公司，有三个检测管：C管、I管、V管，C管对样本的总病毒株进行定量，I管对YIDD变异毒株进行定量，V管对YVDD毒株进行定量；依据I、V管的Ct值与C管Ct值的差值来判定有无变异毒株以及与总病毒株的相对比例）

结 果

一、质粒鉴定结果 重组质粒经酶切鉴定阳性，电泳观察可见阳性条带，目的片段与DNA Marker对比，大小约为400bp；经测序后与HBV全基因组序列进行比对（Vector NTI Suite 7软件），显示插入片段序列与预期一致。

二、质粒浓度的定量结果 质粒M、I、V经紫外分光光度计定量（84ng/μl、98ng/μl、99ng/μl），根据公式换算成拷贝数（2.48×1010拷贝/μl、2.89×1010拷贝/μl、2.92×1010拷贝/μl），并经荧光定量PCR检测后得到验证。

三、不同比例混合的质粒的直接测序 不同比例（I/I+V：50%，60%，67%，75%） 混合的 I和 V 两种质粒，测序图谱（图略）rt612位出现T/G杂合峰（G峰逐渐降低），读出两种密码子：ATT（异亮氨酸-I）及GTG（缬氨酸-V），但以I质粒为主；当I/I+V为80%时，G杂峰低于主峰的30%，很难与背景峰区别，不能判定混合了V质粒。在混合质粒（I/I+V 25%，33%，40%，50%）中，以V质粒为主；在混合质粒（I/I+V 20%）中，不能判定混合了I质粒。

四、单探针特异性实时荧光PCR技术的检验 检测结果（图略）显示，当野生模板与变异模板的比例为10：1时，B 检测液的 Ct值为 23.94；当比例为 1：1时，其Ct值为25.56；当比例为1：10时，因为Ct值为33.11，根据判定标准（B检测液的Ct值＞38时，可以判定为HBV YMDD变异型），此时不能判定该样品为变异型，但实际突变模板已约占10/11；当野生型模板与突变模板的比例为1：50时，Ct值＞40，可判定该样品为YMDD变异型，此时突变模板已约占50/51。

五、引物特异性荧光PCR技术的检验 检测结果（图略）显示，当M质粒以I管进行检测时，检测结果与实际约相差三个数量级；以V管进行检测时，约相差二个数量级；当V质粒以I管进行检测时，检测结果与实际约相差三个数量级；当I质粒以V管进行检测时，检测结果与实际约相差四个数量级。经计算分析，当YIDD突变株占总毒株的比例高于1/101时，I引物的非特异性结合可忽略，当YVDD突变株占总毒株的比例高于1/11时，V引物的非特异性结合可忽略；即只要突变株占总毒株的比例高于1/11时，该技术非特异结合的影响均可忽略，此时具有很好的特异性，同时具有较高的灵敏性，检测突变株占总毒株的最低比例可达到1/11。

讨 论

近年来出现了多种YMDD变异的检测技术，但在特异性及灵敏性方面存在着一定的差异。目前临床上常用的YMDD变异检测有PCR产物直接测序法、单探针特异性荧光PCR法及引物特异性荧光PCR法三种技术。

直接测序法是其他检测方法所参照的“金标准”，但直接测序法往往只能检测到优势株，当变异株高于总毒株的20%时，才能检测到[5]。本研究分析不同比例混合的质粒测序结果，当V质粒占总质粒（V及I质粒）的比例高于25%时，测序图谱出现T/G杂合峰，但以YIDD为主；当V质粒占总质粒的比例为20%时，测序图谱显示以T峰为主，另可见G杂峰，但G杂峰低于T峰高度的30%，很难与背景峰所区别，依据基因测序的常规，不能提示检测到YVDD突变，这与实际情况不符合。所以认为，直接测序法能够检测出优势模板，但当某模板占总模板的比例较低（约20%）时，则难以对该模板进行准确检测，PCR扩增的竞争抑制作用导致优势株的信号掩盖了非优势株的信号，而造成检测结果误差。有学者[3]采用PCR产物克隆测序法进行检测，结果发现慢性乙型肝炎患者在抗病毒治疗前存在YMDD变异株。克隆测序法虽能检测出相对较少的自然变异株，但要经历基因克隆的过程，技术难度高、检测周期长，且挑选克隆测序时，在挑选的有限克隆内可能不能发现变异株，易造成假阴性结果。总之，PCR产物直接测序法适合用于核苷类药物治疗过程中出现的基因型耐药检测，即YMDD变异的“事后检测”，但对于变异株较少的YMDD自然变异来讲，该检测方法灵敏性不够。此外，该方法还存在着其它一些不足：一是技术要求高，费材、费时，不能成为临床实验室的常规技术。二是直接测序前必须进行PCR扩增，对血清HBV的载量有一定的要求，103～104拷贝/ml的血清很难进行PCR扩增和测序。

本研究中我们采用单探针特异性荧光PCR技术检测不同比例混合的质粒，此方法只采用一条能与YMDD野生株互补的Taqman MGB探针，故只能辨别HBV是YMDD野生株或是变异株。结果显示，当野生型模板与突变型模板的比例为1：10时，根据检测的Ct值不能判定该样品为变异型，但实际突变模板已约占10/11；当比例为1：50时，才可以判定该样品为YMDD变异型，此时突变模板已约占50/51。由此可见，本方法可用于HBV DNA的YMDD突变检测，但只能认为适合于YMDD变异株已成为明显优势株的患者，对于YMDD变异株较少的YMDD自然变异，该方法灵敏性明显不够，且不能确定突变株的类型。季秀玲等[6]采用与YMDD野生株互补的Taqman MGB探针对47例正予拉米夫定治疗的患者进行YMDD变异检测，结果有19例为变异株；由于此法灵敏度的不足，不能排除检测的假阴性。目前市场上针对HBV YMDD变异检测的试剂盒多为单探针型，仅采用检测YMDD野生株的探针，可以基本满足拉米夫定等核苷类药物使用过程中基因耐药监测的需用。如果采用检测YMDD突变株的探针，可以提高YMDD变异株检测的灵敏度；分别设计针对YMDD野生株、YIDD及YVDD突变株的探针，根据相应的Ct值来判定突变株的存在。Cane等[7]设计了4条探针，1条上游探针的3′端标记荧光素；3条下游探针的5′端标记另一种荧光素，分别与YMDD、YVDD和YIDD序列相匹配，通过与直接测序的结果比较，显示两种方法的灵敏度及特异性相接近。Malmstrom S等[8]采用此方法检测拉米夫定治疗的患者，检测结果与测序法及RFLP法基本一致。此方法快速方便，但设计多条探针，成本明显加大，并且检测结果还会受到探针非特异性结合及PCR竞争抑制的影响。因此，出于监测核苷类药物治疗过程中YMDD变异的目的，市场上目前仅有单探针特异性的荧光PCR技术的商品试剂盒。

引物特异性荧光PCR技术是根据待测位点的碱基分别设计与野生模板或变异模板结合的引物的，在该技术特异性的验证过程中发现，特异性引物会优先结合到完全互补的碱基上，但也会结合到不完全互补的碱基上。在检测混合模板时，I管中I引物3’末端的碱基（ATT）将优先结合YIDD突变株序列上的TAA三个碱基，同时也会结合YMDD野生株序列上的TAC碱基及YVDD突变株序列上的CAC碱基，只是存在着结合程度的差异。通过我们的实验可确定不同引物结合程度上量的差异，经计算分析，当突变株占总毒株的比例高于1/11时，该技术非特异结合的影响可忽略，此时具有很好的特异性，同时检测模板所占总模板的最低比例可达到1/11，因此适合用于YMDD变异株较少的YMDD自然变异的检测。进一步通过确定相应的ΔCt，能够对变异毒株进行相对定量。Shi M等[9]采用引物特异性荧光PCR技术对98例从未予抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测的结果发现，5例检测出YMDD变异株，变异株占野生株的比例皆在10%～20%。霍红等[10]采用该方法对183例近半年来未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者进行检测，结果示有21例存在YMDD自然变异毒株，其中变异株低于50%者占95.24%（20/21）。由此可见，引物特异性PCR技术适合用于检测YMDD变异株较少的YMDD自然变异。另外INNO-LiPA方法在国外已获准应用于临床检测[11]，该法灵敏度较高，可检测出样品中5%～10%的变异株[12]，但仪器、试剂价格昂贵，国内尚难广泛用于临床检测。

需要指出的是，受本检测方法对变异毒株检出效能的限制，只有变异毒株超过总毒株量约1/11时，才能准确地给予变异株相对定量。因此，通过改善该技术的特异性，从而可进一步提高其灵敏性，以提高YMDD自然变异检出率。由于YIDD变异还有两种少见变异类型，实际检测中会出现此型的漏检，因此在检测系统中补充这两种变异类型的检测将会使该方法更加完美。

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