金针菇多糖的研究进展

郑 义，李 超，王乃馨

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

金针菇多糖的研究进展

郑 义，李 超，王乃馨

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

金针菇多糖是金针菇的主要活性成分之一，近年来因其抗肿瘤和调节免疫等功能成为研究的热点。综述金针菇多糖的提取、纯化、结构和生物活性的研究进展，提出目前金针菇多糖研究中存在的问题，并对其研究方向进行展望。

金针菇；多糖；提取；纯化；结构鉴定；生物活性

Abstract：As the major biological activity components,Flammulina velutipespolysaccharides have attracted tremendous attentions due to their antitumor and immunoregulation functions. Current research progress in the extraction, purification,structure characterization and biological activities of polysaccharides fromFlammulina velutipesare reviewed in this paper.Meanwhile, problems encountered during the investigations ofFlammulina velutipespolysaccharides are also discussed, which will provide a useful guidance for future studies.

Key words：Flammulina velutipes；polysaccharides；extraction；purification；structure characterization；biological activity中图分类号：R284.2；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)17-0425-04

金针菇(Flammulina velutipes)又名朴菇、冬菇，隶属真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口磨科，金钱菌属。金针菇富含蛋白质、碳水化合物、矿物质元素、维生素和粗纤维，含脂肪较低，是一种不可多得的高营养食品，有增智菇和“一休菇”等美称，目前已发展成为世界第三大食用菌。由于其含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、火菇素、火菇毒素、倍半萜等多种生物活性物质[1]，而被认为具有很高的药用价值。金针菇多糖是金针菇的主要活性成分之一，具有抗肿瘤和免疫调节作用。本文就近年来国内外对金针菇多糖的主要研究进展，包括其提取纯化、结构分析、生物活性及存在问题等作一综述。

1 金针菇多糖的提取

食用菌多糖能溶于水、酸、碱、盐溶液，而不溶于醇、醚、酮等有机溶剂，因而多糖的提取常采用水提醇沉法、酸碱浸提法、酶法、超声波法、微波法和超临界流体提取法等[2]。目前，有关金针菇多糖的提取工艺已有不少研究，基本过程如下：新鲜金针菇或金针菇干品→破碎→热水提取(蒸馏水或稀碱液或稀酸液)或酶法提取(单一酶法或复合酶法)或超声提取→浓缩→乙醇沉淀→去除蛋白→洗涤→干燥→金针菇粗多糖。除蛋白的方法主要有Savag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等，其中以Savag法最为常用，即采用氯仿、正丁醇处理多糖水溶液，使蛋白质成分变性沉淀，离心分离。

在上述工艺流程中，影响金针菇多糖提取率的因素较多，包括温度、料液比、提取时间、提取次数以及提取方法等。吴可等[3]对金针菇子实体多糖的提取工艺条件进行优化研究，得出最佳工艺条件为：加水30倍，80℃浸提1h，乙醇终体积分数为60%～70%；氯仿与正丁醇，样品与氯仿-正丁醇体积比分别为1:0.2和1:0.24时，蛋白质去除效果最好。李世敏等[4]对金针菇子实体多糖的提取工艺进行了系统的优化，结果表明，子实体多糖提取的最优工艺为：原料先预处理，经0.15%(占底物的质量分数)的纤维素酶在40℃、pH4.5条件下水解3h，再用20倍样品质量的水在100℃、pH6.5条件下浸提1h，过滤，滤液经MWCO 5000的超滤膜在40℃、0.2MPa条件下浓缩至原体积的1/3后，用70%的乙醇沉淀，经脱蛋白干燥，得到纯品金针菇多糖。占建波等[5]通过单因素试验、正交试验，以多糖浸提率和蛋白质得率双指标探讨金针菇多糖的最佳提取条件，结果表明，温度90℃、浸提时间4h、料液比1:30、提取两次、pH7为金针菇多糖的最佳提取工艺条件；糖液中加入氯仿-正丁醇溶液(5:1)去除蛋白，产率达1.63%。姜宁等[6]在确定了金针菇深层发酵的培养条件的基础上，通过单因素试验和正交试验得出水浴提取金针菇菌丝体多糖的最佳工艺是：料液比1:60，水浴时间90min，水浴温度60℃，并认为摸索最佳水浴时间是提取金针菇菌丝体多糖的技术关键。刘晓鹏等[7]研究了超声辅助提取金针菇菌丝体多糖的最佳工艺，结果表明最佳工艺条件为：料液比1:100、超声强度80W、超声处理时间10min、浸提液pH8.0，超声辅助法提取金针菇菌丝体多糖明显优于水提醇沉法。

2 金针菇多糖的纯化与结构分析

纯化金针菇多糖的目的是进一步除去多糖粗品中的杂质，获得单一组分和一定相对分子质量的多糖，即多糖的分级。目前采用的纯化策略主要是离子交换柱层析或凝胶过滤层析，前者根据多糖的电荷特性不同，后者根据其相对分子质量的差异。在纯化过程中，一般用水、盐或碱洗脱，硫酸-蒽酮法检测，收集主峰多糖，即得到不同的多糖纯品。多糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分类方法，也可分为一级、二级、三级和四级结构，其中二、三、四级结构统称多糖的高级结构，其与多糖的活性关系更加密切。结构分析方法包括X射线衍射法(XRD)、毛细管电泳法(CE)、核磁共振方法(NMR)、圆二色谱(CD)、气-质联用(GC-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、原子力显微镜(AFM)等。

曹培让等[8]从金针菇子实体中提取水溶性多糖，经乙醇分级，DEAE-Sephadex A-25纯化，得到化学均一性多糖PA5DE，相对分子质量4.71×105；用气-液色谱(GLC)、红外光谱(IR)、13C-NMR分析表明含有D-葡萄糖、D-甘露糖、D-岩藻糖；PA5DE分子可能具有分支结构，含β-型糖苷键，存在β(1→3)和β(1→6)型糖苷键连接。Leung等[9]采用薄层层析和凝胶过滤层析分析了金针菇多糖的结构，测得其相对分子质量为2.0×105左右，由β-D-(1→3)-葡聚糖组成。何国庆等[10]用高效液相色谱法从金针菇菌丝体中分离得到了4个组分的多糖，其相对分子质量分别为1.93×106、5.74×105、5.58×104和1.5×104，含量上以后两者为主，分别占66.6%和22.8%。秦小明等[11]采用热水抽提、三氯乙酸法脱蛋白、乙醇沉淀获得金针菇子实体粗多糖，然后经DEAE- Cellulose阴离子交换柱进行分离纯化，得到FVCP-A、FVCP-B和FVCP-C三个多糖组分，并认为金针菇粗多糖成分主要是葡聚糖，同时还可能混有半乳糖聚糖、木糖葡聚糖或者木糖甘露聚糖等数个多糖组分。Smiderle等[12]利用热水提取从金针菇子实体中得到了金针菇多糖，并采用GC-MS、13C-NMR、1H NMR、13C HMQC等方法分析了多糖的结构，结果表明金针菇多糖是一种以[-Glc(1→3)-]为主链的β-葡聚糖，相对分子质量为3.08×105，单糖物质的量比：甘露糖(Man):木糖(Xyl)=3:2。Pang等[13]通过热水提取、阴离子交换层析从金针菇菌丝体中分离得到了一种水溶性多糖FVP-2，结构分析表明，FVP-2由α-D-(1→4)-葡聚糖构成，相对分子质量为1.89×104。王玉峰等[14]通过热水提取、去蛋白、除色素、乙醇沉淀得到金针菇多糖，再通过离子交换法、凝胶柱层析法进行进一步纯化得到精品FVP-1、FVP-2。运用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)，柱前衍生化高效液相色谱(PDHPLC)、IR和13C NMR等方法测定了两种多糖的结构，FVP-1相对分子质量为1.48×104，FVP-2为2.73×104。FVP-1单糖物质的量比为：葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal):甘露糖(Man)=100:2.5:1.5；FVP-2为Glc:Gal:Man:岩藻糖(Fuc)=100:14:7:4。FVP-1主要以[α-D-Glc(1→4)-]为主链，带有α-D-Glc(1→6)分支。FVP-2结构较复杂，存在多种单糖组成，葡萄糖具有α、β两种构型，需通过其他实验进一步分析其精确结构。

3 金针菇多糖的生物活性

3.1 免疫调节

多糖的免疫调节作用是多靶点的，几乎遍及非特异性免疫和特异性免疫应答的各个环节[15]，多糖可通过促进干扰素(IFN)、白细胞介素类(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子的分泌；激活巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和T、B淋巴细胞；促进抗体生成、激活补体系统、促进红细胞免疫功能及增强网状内皮系统等作用增强机体免疫功能[16]。金针菇多糖大多也通过以上几种途径对机体起到免疫调节作用。陈芝芸等[17]研究了金针菇多糖的3个组分FVP1、FVP2、FVP3对小鼠体内脾淋巴细胞转化、NK细胞活性及IL-2产生的影响，结果表明，3种剂量的FVP1、FVP2、FVP3均能使正常与荷瘤小鼠的脾淋巴细胞转化指数、NK细胞活性和IL-2增殖指数明显提高。金针菇多糖FVP1对正常小鼠外周血白细胞无明显影响，但对荷瘤小鼠则有明显的升高白细胞的作用；还能显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能[18]。常花蕾等[19]发现FVP可增强小鼠脾细胞及腹腔渗出细胞代谢MTT的活力，促进小鼠脾细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2，促进小鼠腹腔渗出细胞分泌TNF-α。进一步研究表明，金针菇多糖主要作用于腹腔渗出细胞膜上的TLR4，从而激活p38MAPK信号转导通路，活化转录因子NF-κB，后者启动TNF-α基因转录，最终导致TNF-α的合成与分泌增加[20]。

3.2 抗肿瘤作用

食用菌多糖对肿瘤细胞无直接抑制或杀死作用，主要作为免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能间接发挥抗肿瘤作用[21]。金针菇多糖也是通过增强机体的免疫功能而发挥其抗肿瘤作用的。1968年，Kamasuka等[22]最先报道了金针菇多糖成分的抗肿瘤作用。Ohkuma等[23]采用热水提取得到一种金针菇多糖EA3和一种多糖结合蛋白EA6，它们对小鼠肉瘤S180具有明显的抑制作用，腹腔注射EA6可以显著增强冷冻手术治疗S180实体瘤的疗效，EA3和EA6的抗肿瘤作用是通过提高机体免疫力实现的。Leung等[9]从金针菇子实体中提取出一种碱溶性多糖SFA1，盐水虾法表明SFA1无毒性，小鼠腹腔注射该多糖，可促进脾淋巴细胞增殖，导致肿瘤部位血管扩张和出血，SFA1对体内S180实体瘤有抑制作用，对体外S180肿瘤细胞无作用。陈芝芸等[24]通过腹腔注射给药，显示5、10、20mg/(kg·d)的金针菇多糖FVP1能明显抑制Lewis肺癌的实体瘤，并能抑制其自发性肺转移，表明FVP1有良好的抗肿瘤活性。FVP1小剂量环磷酰胺伍用能显著提高环磷酰胺对小鼠S180的抑瘤率，FVP1对环磷酰胺具有一定的增效减毒作用[25]。苗立成等[26]以小鼠肉瘤(S180)、小鼠肝癌(H22)瘤株及小鼠网状细胞白血病(L615)瘤株造模，设空白对照、正常对照、给药(高、低剂量)4组，分别考察金针菇多糖对各组小鼠抑瘤率和生存期的影响，结果显示金针菇多糖对S180、H22小鼠的抑瘤率分别为50.69%、41.46%以上；对L615白血病小鼠生命延长率达到53.24%以上，其药效呈剂量依赖。

4 结 语

金针菇多糖来源较稳定、质量可控、高效低毒，是一种极具开发潜力的生物活性成分，进一步开展金针菇多糖的提取、分离纯化、结构及药理实验研究，对药物和食品开发以及金针菇资源的利用都具有重要的意义。

目前，有关金针菇多糖的提取主要以水提醇沉法为主，水提醇沉法操作容易、准确度高、成本低廉、适用于大规模的工业生产，但提取效率低且费时，产品纯化困难且活性损失较大。新的提取工艺，如超声波辅助萃取、微波辅助萃取、超临界流体萃取、超滤以及膜分离等已成功用于食用菌多糖的提取，并且显示出传统方法无可比拟的优势，但应用于金针菇多糖提取的研究极少[6]，相信这些新技术在金针菇多糖的提取方面具有巨大的应用前景。用于衡量金针菇多糖提取方法的优劣主要依据多糖得率的高低。一般来讲，多糖得率较高，从中获得活性成分的概率也相对提高，但需要指出的是多糖得率与活性之间并不存在一致性。因此，应选择对活性破坏小、多糖得率相对较高的方法进行提取。

多糖的高级结构对其生物活性的影响较初级结构更为重要，这一点已经得到大多数专家的认可。目前，对金针菇多糖结构的研究主要集中在对一级结构的分析，而对高级结构的研究较少。多糖的化学结构独特、复杂，这就决定了高级结构(尤其是空间构象)和构效关系研究的复杂性和难度，此外高级结构的研究还受到测试手段的限制。所以在今后相当一段时间内，金针菇多糖的高级结构以及构效之间的关系，依旧会是研究的热点和难点。

此外，随着硒、锗等微量元素的抗肿瘤、调节免疫等活性的发现，对硒、锗等微量元素的研究成为热点。在金针菇发酵培养过程中，添加硒、锗等微量元素，经分离纯化得到的富硒金针菇多糖[27-28]、富锗金针菇多糖[29-30]，可集多糖和硒(或锗)等微量元素的生物活性于一身，具较大开发利用价值。

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Research Progress in Polysaccharides fromFlammulina velutipes

ZHENG Yi，LI Chao，WANG Nai-xin
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

2010-05-26

郑义(1982—)，男，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：biozheng@gmail.com