丝素蛋白调控磷酸钙生物矿化的研究进展

沈 彤(绍兴文理学院 元培学院，浙江 绍兴 312000)

丝素蛋白调控磷酸钙生物矿化的研究进展

沈 彤
(绍兴文理学院 元培学院，浙江 绍兴 312000)

总结了当前蚕丝蛋白仿生矿化领域研究的热点内容，阐述了以不同形态(溶液、膜、粉末和纤维)存在的丝素蛋白基质对磷酸钙晶体生长的调控作用，介绍了蚕丝蛋白对磷酸钙晶体形态和结构的影响。

蚕丝蛋白；磷酸钙；基质调控；生物矿化

天然骨是自然界最复杂的生物矿化系统之一，由无机矿物与有机大分子规则排列而成。其无机相具有多型性，最主要的成分是羟基磷灰石(HA)，又含有CO32-、Cl-、F-、Na+、Mg2+等杂质离子，其中CO32-的含量较高，CO32-可取代OH-或PO43-的位置而形成α型或β型碳酸磷灰石(CHA)，一般骨中这两相同时存在。此外，骨中还存在非晶磷酸钙(ACP)、磷酸八钙(OCP)、二水磷酸氢钙(DCPD)和六方碳酸钙等多种矿物相，作为磷灰石的前体相而存在[1]。在整个矿物形成过程中，晶体形核的位点、取向、形状及最终生成的物相都依赖于矿化过程中存在的有机成分及其在矿化生长阶段起到的精密调控作用。而生物体究竟是怎样通过蛋白质来实现对晶体晶型和形貌的调控作用的一直是研究者关注的焦点问题。因此，在体外环境中模拟体内环境，利用有机模板仿生合成类骨材料已成为骨组织工程的重要研究内容之一。

蚕丝蛋白是一种性能优良的天然生物材料，具有优异的力学性能、生物相容性和生物可降解性，且与胶原蛋白同属结构蛋白，提取方法简便，成本低廉，能促进细胞的黏附、扩展和分化，在研究开发骨修复和替代材料方面，已显现出广阔的前景。近年来，人们尝试多种方法将蚕丝蛋白制备成不同的结构和形态，仿生合成生物复合材料运用于骨组织工程。

1 蚕丝蛋白调控磷酸钙生物矿化的研究进展

1.1 丝素溶液调控磷酸钙生物矿化

孔祥东等[2]曾以溶液态的丝素蛋白为有机模板，在pH8、室温条件下调控磷酸钙的矿化过程，研究了不同反应时间收集的磷酸钙沉淀的形貌、物相及结构。TEM图谱表明生成的复合颗粒呈棒状，其直径约2～3 nm，其选区电子衍射表明生成矿物呈多晶环状，XRD分析结果表明所得磷酸钙为羟基磷灰石晶体，且HA具有(002)择优取向。采用FTIR对形成的晶体进行了化学结构分析，结果表明HA晶粒是部分碳酸根取代的HA，且矿化过程丝素蛋白的二级结构发生变化，其酰胺Ⅱ吸收峰位置发生蓝移(由1 517 cm-1到1 539 cm-1)，说明HA和丝素蛋白间形成强烈的化学相互作用。孔祥东等[3]还采用UV/可见光谱技术追踪研究了蛋白浓度对磷酸钙矿化的影响。实验发现蚕丝蛋白的加入极大地影响了生物矿化的动力学过程，较高浓度的蚕丝蛋白有助于生物矿化的进行。在适宜的反应条件下，蚕丝蛋白矿化的动力学曲线有波峰和波谷的出现，出现这种情况主要与相分离有关。XRD结果表明通过波谷前的磷酸钙主要是非晶磷酸钙，而波谷后的磷酸钙成分主要是羟基磷灰石和二水磷酸氢钙。孔祥东等[4]所制备的磷酸钙呈现直径约2～3 nm的纤维状，这些纳米纤维可以聚集成束，直径为6～8 nm，长度可达30～60 nm。

姚菊明等[5]以碱金属离子诱导桑蚕丝素蛋白溶液发生构象转变，研究了蛋白质初始结构对其矿化作用的影响。FTIR、XRD和SEM等测试结果显示，未经任何处理的桑蚕丝素蛋白溶液矿化后形成片状复合物，其无机相以DCPD为主，而经过K+和Na+金属离子处理后，桑蚕丝素蛋白的构象由无规线团/螺旋结构向β-折叠转变，矿化后成纤维状，并相互结合呈现纳米级的三维多孔结构，其无机相以热力学稳定的HA为主。实验认为，丝素蛋白结构转化为较伸展的β-折叠后，使得更多的亲水基团暴露在外面，在丝素蛋白分子不断凝聚成纤过程中，HA结晶快速生长并附着在这些微纤上，最终形成纤维状的丝素蛋白/HA复合物。此外，该研究组[6]还在丝素蛋白/磷酸钙复合材料形成过程中加入不同量的Na2SiO3，以评价硅对复合材料中磷酸钙晶体生成的影响作用。FTIR和XRD结果表明，当Na2SiO3最终质量分数低于0.008 %时，复合材料中的无机相主要是DCPD，也就是骨中HA生成的前体。相反的，高于该质量分数，复合材料中的无机相则主要是HA。且Na2SiO3质量分数偏低时，形成的磷酸钙晶体呈片状，而更高质量分数时则为棒状。棒状晶体相互交联成网络结构，这是因为HA生成的同时伴随着丝素蛋白组装成微纤维。这一过程中，丝素蛋白构象也从α-螺旋转变为反向β折叠结构。TG分析结果表明SiO32-的加入，复合材料具有更好的热稳定性。该研究组的研究结果为阐明蛋白质的生物矿化过程及其调控机理提供了理论依据，同时可以从矿化复合物的形成来反映这些微量元素可能对骨组织形成的影响, 为临床骨组织的修复提供一定的参考。

1.2 丝素蛋白膜调控磷酸钙生物矿化

姚菊明研究组[7]以丝素蛋白膜为基质，在模拟体液中诱导羟基磷灰石晶体在其表面沉积和生长。利用XRD，SEM，HRTEM，AFM和FTIR等表征手段研究了不同预处理方法对羟基磷灰石晶体的形成及其微观形貌的影响。结果表明，丝素膜可有效地诱导羟基磷灰石晶体在其表面沉积和生长，HA晶体呈针状晶须或由针状晶须组装成簇状形式规律分布在膜表面。丝素蛋白膜调控羟基磷灰石晶体生长的机制研究表明矿化时间主要从结晶度和晶体形成数量方面对HA晶体产生影响，而预处理方法则影响了HA晶体的生长方式。这主要是由于不同的预处理，改变了丝素蛋白膜的表面结构，使得蛋白膜表面亲水基团重新排列，增加了Ca2+和/或PO43-等的结合位点，且这些位点组成的矩阵具有一定的排列特性，其排列方式与HA晶体的某些晶面上较长钙磷离子的排列方式相匹配，致使晶体成核及生长过程中发生择优取向。

Kino等[8]通过铸膜及甲醇处理制备了不同氯化钙含量的丝素蛋白膜，然后将得到的丝素膜浸泡在1.5倍模拟体液(1.5 SBF)中，研究沉积的磷酸钙晶体结构。试验发现CaCl2质量分数低于3 %的丝素膜不发生矿化作用，而质量分数高于3 %的丝素膜在6 h后发生矿化作用。X射线衍射和ICP直流等离子体发射光谱分析表明：HA是由水解后的磷酸钙生成，这可由衍射强度的变化及1.5 SBF条件下钙离子和磷酸根离子浓度的变化而知。随后，将质量分数为5 % CaCl2的丝素蛋白膜浸泡在模拟体液中沉淀生成HA晶体。通过热压缩法，即130 ℃和3 MPa条件下处理4 min后制备多层HA/SF 复合膜和纯SF膜(4层)。2种样品中的β折叠构象含量相差不多，分别为55.8 %和55.1 %。将2种膜材料分别置于含有和不含蛋白酶XIV的磷酸缓冲液中处理1～14 d，检测膜的膨胀率和体外降解率，同时对样品的质量和张力的改变情况进行了研究。与纯SF膜相比，含有HA的多层膜降解缓慢，且具有更高的机械强度[9]。

1.3 丝素蛋白粉调控磷酸钙生物矿化

Wang等[10]对丝素蛋白粉进行预处理，通过湿态机械化学法合成了包含羟基磷灰石和丝素蛋白的纳米复合材料。试验首先将丝素蛋白粉(SF)均匀分散在Ca(OH)2溶液中进行碱液预处理，然后向该悬浮液中加入H3PO4溶液，合成了HA/SF纳米复合材料。碱性溶液处理SF颗粒，增加丝素基质和钙磷离子的接触位点。使得到的HA晶粒在SF基质上沿着晶体学c-轴择优生长。合成的复合材料显示了70%开放多孔结构，且内部孔的直径在40～115 μm之间。丝素蛋白酰胺Ⅱ峰位置的变化表明，碱性溶液预处理SF加强了HA晶粒与SF基质间的化学作用。这种较强的无机－有机相互作用促进了三维网络结构贯穿材料内部，并引起材料维氏硬度增加了63 %。Wang等[11]还采用蛋白酶K化学修饰丝素蛋白来加强HA基纳米复合材料中无机相和有机相之间的化学相互作用，取得了同样的结果。对复合材料中HA结晶学性能和材料显微结构、显微硬度的研究表明，HA纳米晶须在沿c-轴生长时表现了较强的取向性自组装和各向异性的晶体生长特性。合成的复合材料显示了70 %开放多孔结构，孔粒径分布在10～115 μm范围内。由于酶的修饰作用，HA晶簇和SF基质的交联度提高，增加了复合材料中的网络结构，使得复合材料的显微硬度提高了35 %。此外，HA/SF纳米复合材料中SF含量对复合材料微观结构和物理化学性质也有很大的影响[12]。SF的加入，使HA沿c-轴和α-轴方向的生长都受到了抑制。当SF的质量分数为30 %时，材料内部颗粒形貌相近，HA晶粒分散均匀，材料呈现三维网络结构。而当其质量分数增加到40 %时，材料微粒尺寸分布范围缩小，复合物的Vickers显微硬度增加4倍。复合材料具有多孔微观结构，孔隙率为62 %～74 %，微孔直径约70 %分布在40～115 μm之间。

基于Wang等[13]的研究可以发现，碱液和酶预处理的丝素暴露出更多的活性位点，诱导HA沿c-轴的择优取向，并有效改善无机相和有机相之间的界面结合，促进复合材料三维网络结构的形成，增加纤维硬度。

1.4 丝素纤维调控磷酸钙生物矿化

人体骨是由无机磷灰石晶体和有机的胶原纤维构成的高度有序的三维复合结构。为了仿生制备该类生物复合材料，一个令人瞩目的战略便是选择性地使磷灰石晶体在聚合物上生长，并对其结构、机械强度和功能进行控制。Tamada等[14]采用polymethacryloylox yethylphosphate(pMOEP)接枝蚕丝织物。与未处理蚕丝织物相比，pMOEP接枝后，蚕丝织物对Ca2+吸附能力明显提高。SEM观察显示在模拟体液中浸泡1周之后，pMOEP接枝的蚕丝织物上沉积有微晶体，而未处理的蚕丝织物上却没有发生结晶现象。X射线衍射表明微晶中包含有羟基磷灰石。该结果表明pMOEP接枝后的蚕丝织物比未处理织物更能有效诱导羟基磷灰石晶体形成。

Furuzono等[15]以蚕丝织物为模板，通过循环浸泡处理过程制备了沉积钙磷盐的蚕丝复合材料，并用SEM，XRD，FTIR以及XPS对沉积的磷酸钙形貌和结构进行研究。在Ca2+溶液(200 mM CaCl2-tris-HCl缓水溶液，pH7.4)和PO43-溶液(120 mM Na2HPO4)中每隔1 h轮流浸泡后，磷酸钙的沉积量相应增加。SEM观察表明经21次或更多次的循环浸泡之后，磷酸钙的沉积厚度已超过20 μm。XRD显示经过循环浸泡，沉积的磷酸钙晶体的长径比增加。FTIR和XPS表明，除了构成羟基磷灰石的基团，沉淀中还有CO32-，HPO42-和Na+离子。在继续浸泡的过程中，沉积物中HPO42-和Na+含量降低，这与磷酸钙结晶度的增加有关。通过循环浸泡，在蚕丝蛋白上沉积的磷酸钙中是一种缺陷型晶体，和天然骨组织中类似，包含CO32-，HPO42-和Na+等离子。因此，这种磷酸钙-蚕丝蛋白复合材料可能是具有生物活性的。

Li等[16]通过在电纺丝制备的具有纳米直径的活化丝素纤维上沉积磷灰石而制备了丝素/磷灰石三维复合材料。活化丝素由丝素/PEO(polyethylene oxide)水溶液纺丝而得，作为天然骨中非胶原蛋白的类似物，该溶液中引入了多聚天冬氨酸(poly-Asp)。丝素蛋白以及酸性poly-Asp充当了矿化的模板。磷灰石矿物沿纤维的长轴方向择优生长，而在缺少模板蛋白时，该现象即使在合适的反应浓度下也不会出现。能谱和XRD证实了沉积的矿物是磷灰石。Zhao等[17]将静电纺丝制备的丝素无纺布交替在钙盐溶液和磷酸盐溶液中浸润制得SF/HA复合支架材料。复合材料中HA晶体呈现纳米尺寸的针状形态，直径为20～60 nm，长度为100～300 nm。复合支架材料具有多孔微结构，孔尺寸平均在(163±40 μm)，孔隙率达70 %～78 %。复合材料显示了良好的亲水性，其膨胀率和吸水率分别为4.55 %和81.93 %。该材料用于成骨细胞培养，显示了良好的细胞相容性。

2 蚕丝蛋白调控磷酸钙生物矿化的发展趋势

仿生矿化是开发新型生物材料的有效方法。蚕丝蛋白作为天然高分子蛋白质，具有优良的机械性能和生物相容性，易于加工成型。经过处理得到的丝素蛋白溶液、丝素膜、丝素粉末及丝素纤维均可诱导磷酸钙等无机矿物的沉积和生长。通过改变蚕丝蛋白初始结构，对蚕丝蛋白表面功能基团预处理等手段，可有效调控磷酸钙晶体的形貌和化学结构，这对认识有机模板在调控晶体形核、生长及微结构的有序组装过程中发挥的调控作用提供科学参考，也为研制出更理想的人工骨组织工程材料提供实验依据。但一直以来，研究者仍无法模拟合成出类自然骨、牙的硬组织材料，其主要原因是生物体内的矿化是在有活细胞参与及多种调控情况下，在蛋白基质上进行的复杂而有序的精密过程，因此，未来的研究不仅是研究矿化位点基质组成和位点附近介质的影响，还要探索细胞及基因对矿化过程的调控作用。

[1]崔福斋，冯庆玲，唐睿康，等.生物矿化[M].北京：清华大学出版社，2007：17-19.

[2]KONG X D, CUI F Z, WANG X M, et al. Silk Fibroin Regulated Mineralization of Hydroxyapatite Nanocrystals[J]. J Cryst Growth, 2004, 270(1-2):197-202.

[3]KONG X D, SUN X D, CUI F Z, et al. Effect of Solute Concentration on Fibroin Regulated Biomineralization of Calcium Phosphate[J]. Mater Sci Eng C-Biomimetic Supramol Syst, 2006, 26(4):639-643.

[4]KONG X D, WANG X M, YU X, et al. Preparation of Hydroxyapatite-fi broin Nanocomposites[J]. Key Eng Mater, 2005, 288-289: 191-194.

[5]YAO J M, WEI K M, LI L, et al. Effect of Initial Bombyx Mori Silk Fibroin Structure on the Protein Biomineralization[J]. Acta Chim Sinica, 2007, 65(7): 635-639.

[6]LI L, WEI K M, LIN F, et al. Effect of Silicon on the Formation of Silk Fibroin/Calcium Phosphate Composite[J]. J Mater Sci-Mater Med, 2008, 19(2): 577-582.

[7]LI Y C, CAI Y R, KONG X D, et al. Anisotropic Growth of Hydroxyapatite on the Silk Fibroin Films[J]. Appl Surf Sci,2008, 255(5): 1681-1685.

[8]KINO R, IKOMA T, MONKAWA A, et al. Deposition of Bone-like Apatite on Modified Silk Fibroin Films from Simulated Body Fluid[J]. J Appl Polym Sci,2006, 99(5): 2822-2830.

[9]KINO R, IKOMA T, YUNOKI S, et al. Biodegradation of Multilayer Silk Fibroin and Hydroxyapatite Composite Material[J]. Key Eng Mater, 2006, 309-311:1169-1172.

[10]WANG L, NEMOTO R, SENNA M. Effects of Alkali Pretreatment of Silk Fibroin on Microstructure and Properties of Hydroxyapatite-silk Fibroin Nanocomposite[J]. J Mater Sci-Mater Med, 2004, 15(3):261-265.

[11]WANG L, NEMOTO R, SENNA M. Three-dimensional Porous Network Structure Developed in Hydroxyapatitebased Nanocomposites Containing Enzyme Pretreated Silk Fibroin[J]. J Nanopart Res,2004, 6(1):91-98.

[12]WANG L, NEMOTO R, SENNA M. Changes in Microstructure and Physico-chemical Properties of Hydroxyapatitesilk Fibroin Nanocomposite with Varying Silk Fibroin Content[J]. J European Ceram Soc,2004, 24(9): 2707-2715.

[13]WANG L, Li C Z, SENNA M. High-affi nity Integration of Hydroxyapatite Nanoparticles with Chemically Modified Silk Fibroin[J]. J Nanopart Res,2007, 9(5):919-929.

[14]TAMADA Y, FURUZONO T, TAGUCHI T, et al. Ca-adsorption and Apatite Deposition on Silk Fabrics Modifi ed with Phosphate Polymer Chains[J]. J Biomater Sci-Polym Ed, 1999, 10(7): 787-793.

[15]FURUZONO T, TAGUCHI T, KISHIDA A, et al. Preparation and Characterization of Apatite Deposited on Silk Fabric Using an Alternate Soaking Process[J]. J Biomed Mater Res, 2000, 50(3):344-352.

[16]LI C M, JIN H J, BOTSARIS G D, et al. Silk Apatite Composites From Electrospun Fibers[J]. J Mater Res,2005, 20(12): 3374-3384.

[17]ZHAO Y, CHEN J, CHOU A H K, et al. Nonwoven Silk Fibroin Net/nano-hydroxyapatite Scaffold: Preparation and Characterization[J]. J Biomed Mater Res(Part A), 2009, 91A(4): 1140-1149.

Developments of Current Researches on Biomineralization of Calcium Phosphate Regulated by Silk Fibroin

SHEN Tong
(Department of Life Science, Yuanpei College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China)

As a natural biomaterial, silk fibroin has outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradation, which provides an important basis for exploiting this protein for tissue engineering applications. In this paper, biomineralization of calcium phosphate regulated by various forms silk fibroin (solution, film, powder and fiber) was reviewed, the effect of silk fibroin on the morphology and structure of calcium phosphate was analyzed. Thereout, the strategies in biomineralization of calcium phosphate was presumed.

Silk fibroin; Calcium phosphate; Stroma regulation; Biomineralization

O629；O636

A

1001-7003(2010)07-0023-04

2010-04-18

国家自然科学基金(10672145)；浙江省自然科学基金(Y205468)

沈彤(1986－ )，男，本科生，专业为生物科学。