转vip3基因作物研究进展

李朋波，曹美莲，杨六六，刘惠民，李燕娥

（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2.山西省农业科学院，山西太原030006）

商业化转基因作物自从1996年问世以来，在生产上已被广泛地应用。2009年，世界上有25个国家种植了1.34亿hm2的转基因作物，其中，以转基因大豆、棉花、玉米和油菜为主要种类[1-2]。除了我国具有丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的转基因棉花外，全世界范围内商业化应用的主要抗虫基因是苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因[3]。转Bt基因棉花在全球棉花生产中发挥了重要的作用。在我国，转Bt基因抗虫棉是应用最成功、面积最广的抗虫棉类型，1997—2009年，转基因抗虫棉累计推广面积达2 100万hm2，其中2009年达370万hm2，占全国棉花种植面积的68%[1]。抗虫棉的种植不仅有效控制了棉铃虫对棉花的为害，而且高度抑制了棉铃虫在玉米、大豆、花生和蔬菜等其他作物上的发生与为害[4]。

1 单一转Bt基因作物的应用风险

Bt（Bacillus thuringiensis）基因是从苏云金芽孢杆菌中分离的编码杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）基因，是目前研究最为深入、应用范围最广的杀虫基因。然而，在全世界除转Bt基因抗虫植物外，还有90%以上的微生物杀虫剂采用Bt制剂，因此，单一的杀虫毒蛋白就极有可能诱发害虫对Bt基因产生抗性。在田间生产中发现，高剂量使用Bt杀虫剂的地方有一些鳞翅目害虫已经产生了抗性，而实验室研究也表明，经过多代的筛选，害虫产生了隐性的抗性基因[5-9]。长期种植转Bt基因棉花，害虫就可以对杀虫毒蛋白产生抗性。我国种植转Bt基因抗虫棉已达十余年，在抗虫棉种植面积较大的棉区，棉铃虫的抗性已提高5倍左右[10-12]。在国外，常采用种植非转基因作物作为“庇护所”来延缓害虫对Bt产生抗性，但我国单个农户的种植面积比较小，采用种植非转基因植物作为“庇护所”的方法在执行上困难比较大，延缓害虫抗性的产生是一个长期利用转基因棉花的重要挑战。同时，尽管Bt基因δ-内毒素是有效的杀虫蛋白，但是在实际应用中仍有许多重要农作物害虫对杀虫晶体蛋白毒素不敏感，如为害50多种农作物的小地老虎。小地老虎取食棉苗，造成缺苗断垄，往往给棉花生产带来较大的损失，因此，对于其他害虫的控制也成为当前抗虫棉培育的重要方向之一，利用具有不同于ICPs杀虫机理的新型杀虫蛋白发展抗虫棉是棉花生产的当务之急。

2 VIP杀虫蛋白

转基因抗虫棉问世以来，科学家为了拓宽基因抗虫谱及提高抗虫性，对包括Bt基因家族在内的其他类型的抗虫基因进行了广泛的研究，并取得了可喜的进展。研究发现，在苏云金芽孢杆菌的营养生长阶段，可分泌另一种非δ-内毒素的杀虫蛋白VIPs（Vegatative insecticidal protein，VIP）[13]。VIPs是芽孢杆菌在对数生长期分泌的一类新型杀虫毒素蛋白，被称为第二代杀虫蛋白，主要分为VIP1，VIP2和VIP3等3种[14]。VIP1和VIP2构成二元毒素，对鞘翅目叶甲科的昆虫具有杀虫特异性[15]，而VIP3对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性[13]。

在VIP3中已发现多个类型，其中，VIP3A蛋白最早由Estruch等报道，是一种广谱杀虫蛋白，目前已发现的VIP3A蛋白有8类[16]。VIP3A对小地老虎（Agrois ipsilon）有高杀活性，比毒蛋白Cry1Ac毒力高260倍；对草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens）、美洲棉铃虫（Helicoverpa zea）、玉米螟（Pyrausta nubilalis）等鳞翅目害虫有较好杀虫活性[13，17]。一些研究表明，对不同的杀虫基因重组后表达的融合蛋白亦可增强对鳞翅目害虫的毒性，单独的VIP3Ac1和VIP3Aa1对欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）杀虫活性极低，但将2个基因重组后表达了一种嵌合蛋白VIP3AcAa，则对欧洲玉米螟表现出很高的杀虫活性[18]。

VIP3与已知的ICPs没有序列同源性和结构相似性[13]，ICPs对昆虫的毒杀作用主要是由于芽孢形成期产生的伴孢晶体导致的[19]；VIP3为可溶性蛋白，不需通过昆虫中肠的消化即可直接起作用，通过诱发中肠细胞凋亡，最终导致昆虫死亡。VIP3与广泛使用的Cry晶体杀虫毒素杀虫机理不相同，这是由于在鳞翅目昆虫中，VIP3的氨基肽酶N端与钙黏蛋白类似物的受体不同于Cry1Ab或Cry1Ac[20]。通过比较VIP3对敏感和抗Cry1Ac的粉纹夜蛾的杀虫活性，VIP3Ab2，VIP3Aa1和VIP3AbAa对敏感和抗性昆虫都具有很高的杀虫活性[21]，且对Bt毒蛋白产生抗性的烟芽夜蛾品系也表现对VIP3A蛋白的高度敏感性[22]，这说明VIP3A和Cry1A这2种蛋白无交互抗性。因此，VIP3可用于抗性害虫的防治和研制构建高效、广谱的杀虫蛋白基因。

3 转vip3基因作物研究与应用

3.1 转vip3基因作物的应用进展

先正达公司在全球最早开展了vip3转基因研究，已将vip3成功地应用于转基因杀虫植物的构建，并在棉花和玉米中首先得到应用。2003年研制成功表达VIP3A毒蛋白的棉花品种COT102，随后又采用转vip3A基因棉花COT102与转cry1Ab基因棉花COT67B杂交选育而成VipCotTM棉花[23]，是首个含有VIPs和Cry蛋白的转基因棉花。2007年培育出转vip3Aa 20的转基因玉米品系MIR162。目前，美国已成功培育含有VIP3A的玉米Agrisure VipteraTM3111[24]，是集合转vip3A基因玉米Agrisure Viptera与抗虫、抗除草剂玉米Agrisure 3000GT的优良性状选育的新品种，这一品种可以非常有效地控制影响玉米产量和品质的14种地上及地下害虫，这在未来的玉米生产中必将发挥重要作用。2010年，先正达公司研制的含VIP3A蛋白的棉花和玉米获得美国环境保护署的批准[25-26]，可将含有VIP3A蛋白的转基因作物用于防治对Bt基因产生抗性的鳞翅目害虫，同时，采用这种棉花和玉米还可以毒杀田间大多数的鳞翅目害虫，极大地拓宽了转基因作物的抗虫谱。预计到2011年，美国将开始种植含有VIP3A蛋白的棉花品种和玉米杂交种。在国家转基因专项的资助下，我国也积极开展了对vip3基因的研究与利用。浙江大学与山西省农业科学院棉花研究所等单位合作，利用国内获得的新型vip3基因及其改造成果，构建具有自主知识产权的重组vip3与cry1A融合基因，可望实现对棉花、玉米、水稻等主要作物鳞翅目害虫广谱高抗的育种目标。

3.2 转vip3基因作物杀虫效果

转vip基因植物可以提高植物的抗虫性，减少损失。Estruch等于1998年成功地将vip3A（a）基因与不同的启动子（如PEPC，Ubi和MTL等）构建成表达载体，通过粒子轰击法导入玉米愈伤组织，得到的转基因玉米对小地老虎和草地夜蛾的杀虫效果都很好；后来又将转vip3A基因玉米与转cry1B基因、转cry1Ab及转cry9C基因玉米分别杂交，得到的杂交后代中有部分植株对欧洲玉米螟和草地夜蛾均有杀虫效果[17]。同时，vip3A基因也被转化到棉花中。饲喂试验表明，vip3A对多种鳞翅目害虫表现了高的抗性[27]。大田接虫试验表明，含有VIP3A的棉花品系对甜菜夜蛾与草地夜蛾的毒杀作用强于Cry1Ab棉花品系，而对于烟芽夜蛾的作用则相反[28]。采用VIP3A与Cry1Ab共表达的棉花冻干组织进行生测，结果表明，含4%的组织可完全毒杀烟芽夜蛾，含0.8%的组织饲喂幼虫平均死亡率达97.3%，2种浓度对棉铃虫都具有100%的毒杀作用。由于大龄幼虫具有更高的耐受性，因此，采用1龄期和4龄期棉铃虫饲喂VIP3A与Cry1Ab共表达的叶片，表明对这2种幼虫都具有100%的杀虫效果。大田接虫试验表明，7 d后转基因棉花中烟芽夜蛾和棉铃虫的死亡率达99.9%以上，完全抑制了害虫的发生[23]。将cry1Ab与vip3H融合基因转化水稻，获得的转基因各个组织均可以表达Cry1Ab与VIP3H蛋白，表达量从多到少依次为叶片、茎秆、根和种子，转基因抗虫水稻在小规模田间试验时对稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medialis）具有良好的抗性[21]。

3.3 转vip3基因作物对环境生物的影响

对于新型转基因作物的出现，人们关注的另外一个焦点问题是转VIP3基因作物对环境生物是否安全。采用转VIP3A基因玉米饲喂肉鸡试验表明，经过49 d的喂养，VIP3A对公鸡与母鸡宰杀产量没有明显影响，临床血液学分析也没有因饲喂转vip3A基因玉米而产生影响[29]。通过研究转基因玉米田的节肢动物群落，表达VIP3A蛋白的玉米田中非靶标节肢动物整体的生物多样性和群体水平与常规玉米没有显著的差异，然而，在转Bt基因玉米田却有部分物种发生了显著的改变[30-31]。而对转基因玉米MIR162进行研究，发现其对环境生物和人类健康均无明显的影响[32]。从现有研究结果看，转vip3基因植物对人类、家禽及田间非靶标节肢动物不具有危害性的影响，可以安全地用于作物害虫的防治。

综上所述，转Bt基因棉花、玉米等作物为防治棉铃虫与玉米螟等害虫起到了重要作用，新型转vip3基因作物具有防治对转基因作物产生抗性的害虫及扩大抗虫谱的优势，为了延长转Bt基因作物的田间应用寿命，应该进一步研究2种转基因作物的科学合理搭配种植方案，降低转基因作物“失效”的风险，确保作物安全高效生产。

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