基质金属蛋白酶9与糖尿病动脉粥样硬化*1

郑冠琳 亓文波 杨利波

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.泰山医学院附属泰山医院内分泌科，山东 泰安 271000)

大血管病变是2型糖尿病的主要慢性并发症,也是2型糖尿病死亡的主要原因,其基本病理变化是动脉粥样硬化。糖尿病人易患动脉粥样硬化,其机制与动脉粥样硬化的主要危险因素:肥胖、高胰岛素血症、脂质异常、高血压、高凝状态所组成的胰岛素抵抗综合征有关。2型糖尿病的广泛代谢异常，使作为血管壁的主要成分的细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)降解在动脉粥样硬化的发生中起重要作用，基质金属蛋白酶是ECM代谢中的关键酶之一,其与AS斑块的形成和破裂有密切联系。其中基质金属蛋白酶9(MMP-9)作用最强。

1 MMP-9概述

1.1 基质金属蛋白酶家族

基质金属蛋白酶类(MMPS)是一类锌离子依赖的蛋白酶家族，1962年首先发现MMP-1,目前已识别和定性的有23种[1]，根据其在细胞中表达的部位不同，可分为胞型和膜型两大类，前者分布在胞质中，后者表达在细胞膜上。胞质型MMP根据其作用底物的特异性、敏感性和氨基酸序列的同源性分为三大类:间质胶原酶、明胶酶、间充质溶解素[2]。其主要功能是降解和重塑细胞外基质,在正常的胚胎发育和组织重塑等生理过程以及一些疾病的病理生理中起重要作用。

1.2 MMP-9的发现及结构

MMP-9属于明胶酶的一种，又称明胶酶B。1974年从人的中性粒细胞中首次提纯，1989年的金属蛋白酶学会上被正式命名[3]。分子量为92000，是已经发现的MMPs中分子量最大的酶。人MMP-9基因位于20q11.2-13.1,全长26000,包括7700的结构基因、15000的5’端侧翼及3500的3’端侧翼区，含13个外显子和12个内含子。MMP-9共包含7个结构域[4],其中包括所有MMPs共有的结构域:信号肽、前肽、催化域及C-末端的凝血素样结构域(MMP-7除外),还包括纤连蛋白分子(fibronectin,FN)样结构域、α2V胶原样结构域(由富含脯氨酸的54个氨基酸残基组成,借此与MMP-2/明胶酶A相区别)和铰链区。前肽区含半胱氨酸残基掩盖Zn2+结合位点, 使酶处于失活状态。催化区含一个Zn2+结合位点, 使酶与底物结合和一个Ca2+结合位点, 对酶起稳定作用。

1.3 MMP-9的表达及活性调节

MMP-9在人体内多种细胞中表达。主要表达于单核细胞、巨噬细胞、角化细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、破骨细胞、骨骼肌卫星细胞、软骨细胞、内皮细胞和各种肿瘤细胞等[5-6]。并且在巨噬细胞中表达最明显。MMP-9的调节主要通过3个水平实现：①基因转录：可能通过转录因子活化蛋白-1(Ap-1)和核转录因子-κB(NF-κB)[4]途径实现，体内许多炎性细胞因子如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-18、TNF-α、TNF-β、前列腺素抑制剂，生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)及其他MMPs的激活均能诱导或刺激MMP-9在转录水平的表达；而白介素4则能抑制MMP-9的表达；②酶原激活：MMP-9在体内是以前体或酶原形式分泌的, 在细胞外激活,通常在中性环境中和Ca2+参与时产生活性,发挥其降解细胞外基质的作用；③MMP-9的生理性抑制物(TIMP-1)：TIMP- 1是一种28 kd 的糖蛋白, 能特异性地通过N 末端半胱氨酸残基与MMP- 9 的Zn2+结合位点以1︰1 克分子比例结合, 从而封闭其催化活性。

1.4 MMP-9的功能

MMP-9是降解Ⅳ型胶原的最主要成员之一,其底物主要是Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原,明胶及弹性纤维。在正常生理情况下,能够切断任何细胞外基质成分,调节细胞黏着，作用于细胞外成分或其它蛋白成分而启动潜在生物学功能、直接或间接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理功能。但在病理条件下,MMP- 9 及TIMP-1表达和活性紊乱,比例失调,通过降解ECM、改变ECM微环境及裂解某些片断, 使细胞从黏附状态解离出来, 介导细胞迁徙;影响细胞增殖、凋亡、分化和机化;调节许多生物活性分子及蛋白酶的活性，因此引发或加重一些疾病的进展如肿瘤浸润、动脉粥样硬化、器官纤维化、关节炎等。

2 MMP-9与动脉粥样硬化

AS形成和发展过程也是ECM重构的过程,MMP作为强大的降解ECM的蛋白酶从中发挥了重要作用。正常动脉壁、MMP和TIMP处于平衡状态,有助于ECM合成与降解相对平衡和ECM成分相对稳定。但在AS, MMP与TIMP失去平衡,突出表现为MMP表达增加,活性增强,使ECM的合成和降解也失去平衡, 通过血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖、凋亡及细胞外基质的重塑促发了AS及斑块破裂。

2.1 MMP-9在VSMC迁移、增殖中的作用

正常VSMC主要位于中膜层,周围为基底膜所包绕。血管损伤后,VSMC增殖并从中膜移至内膜,形成新生内膜,从而触发AS的发生。Galis等[7]证明损伤血管局部释放的IL-1、TNF-α可刺激VSMC使活化MMP-9的表达增高。Mason等[8]通过对鼠转染MMP-9 cDNA,体外用胶原侵入法及博伊登室法测定SMC迁移,体内通过测量侵犯内膜和中膜层的SMC以确定迁移。结果体外实验MMP-9过度表达增强SMC迁移,体内实验SMC迁移至动脉基质。体外实验证实人工合成的广谱MMPs抑制剂可抑制VSMC增殖。Cho等[9]将实验鼠分成两组,一组为野生型(WT),一组敲除MMP-9基因(MMP-9-/-)，结扎颈总动脉使之发生重构，于第4周处死实验鼠，结果WT组内膜明显增厚,管腔狭窄,平滑肌数目明显增多(P<0. 05), 证明MMP-9是平滑肌细胞迁移和增殖所必需的。

2.2 MMP-9在斑块裂解中的作用

冠状动脉粥样硬化斑块破裂并触发血栓形成,是导致急性冠状动脉综合征的重要机制。易于破裂的动脉粥样硬化斑块往往具有以下特征:脂质池大,纤维帽薄,纤维帽中的胶原纤维含量和平滑肌细胞少。斑块纤维帽中的胶原纤维和弹性纤维含量,对斑块稳定起重要作用。MMP-9能降解斑块纤维帽内细胞外基质的主要成分——胶原蛋白和弹性蛋白。因而MMP-9通过降解纤维帽内ECM加速斑块破裂。Galiis等[7]研究表明,在人类硬化动脉的斑块肩部及巨噬泡沫细胞聚集区显示了MMP-9的表达增高,且所有的斑块抽提物被证实含明胶酶的活化形式。Brown等[10]观察冠状动脉旋切术斑块中MMP-9的表达，发现不稳定心绞痛患者冠状动脉斑块中MMP-9阳性表达占83%,稳定性心绞痛患者斑块中MMP-9阳性表达占25%,而正常无病变的内乳动脉则无阳性表达。Gough等[11]通过转染逆转录病毒, apoE-/-鼠巨噬细胞过度表达MMP-9,降解AS基质,导致斑块急性破裂。Loftus等[12]的研究材料取自于连续75例行颈动脉内膜切除术的患者,根据症状将他们分为4组:无症状组、术前症状持续6个月组、症状持续1～6个月组、症状出现于1个月内组。斑块组织学检查并用酶标法和酶联免疫吸附实验对MMP-9进行定量分析。结果发现,MMP-9的水平在第4组中显著升高(均值125.7 μg/L,其余各组均值<32 μg/L(P=0. 003)。也表明在人的不稳定的颈动脉斑块中,MMP-9的表达也明显升高。Kai等[13]的研究结果显示不稳定型心绞痛和心肌梗死患者MMP-9水平明显高于稳定型心绞痛和正常对照组。

3 MMP-9与糖尿病

3.1 MMP-9与糖尿病动脉粥样硬化

大血管病变是2型糖尿病的主要慢性并发症,也是2型糖尿病死亡的主要原因,其基本病理变化是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化过程中,血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、泡沫细胞均能合成和分泌MMP-9,尤以巨噬细胞作用最强,MMP-9降解基底膜,利于单核细胞入侵,加速ox-LDL渗透。使糖尿病动脉粥样斑块较非糖尿病者更不稳定。众多研究表明2型糖尿病合并AS病变者MMP-9水平较单纯2型糖尿病者或单纯AS者明显升高。在动物模型中，Uemura等[14]用明胶酶谱及Western印迹分析、电子顺磁共振等检测发现,不管是1型还是2型啮齿类糖尿病动物模型,其血管组织和血浆中MMP-9均明显升高。Camp等[15]用酶谱分析方法观察到与非糖尿病野生型鼠相比,糖尿病野生鼠血浆和左心室中MMP-9的活性升高。而对糖尿病鼠而言,不管是野生型还是MMP-9基因敲除鼠,心脏组织型TIMP的浓度均减少。而且MMP-9活性的升高与心脏内皮功能紊乱密切相关。在人体，李佳等[16]报道, 2型糖尿病患者血清MMP-9含量明显高于非糖尿病患者,治疗4周时,MMP-9水平即明显下降,且其降低与HbA1c的降低呈正相关。在分子水平，Death等[17]也发现高糖培养可导致内皮细胞和单核细胞MMP/TIMP系统表达失衡,特别是可使单核巨噬细胞MMP-9表达和活性升高(P<0.05),加速糖尿病AS的形成并降低斑块稳定性。另外MMPs基因多态性与糖尿病大血管病变的发生有密切关系。刘宽芝等[18]发现与对照组和2型糖尿病组相比,大血管病变组的T等位基因和TT等位基因型频率显著高于健康对照组和无并发症组。

糖尿病引起MMP-9升高的机制目前研究主要集中在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)和某些细胞因子的作用。糖尿病机体中低密度脂蛋白(LDL)的糖化和氧化明显增加，Ox-LDL可直接上调单核细胞源性的巨噬细胞中MMP-9的表达,而高密度脂蛋白(HDL-C)可阻断Ox-LDL的上述效应。2型糖尿病患者往往存在不同程度的IR,使高血压的发病率显著上升,长期的高血压可使血管内皮功能受损,加速糖尿病血管病变的发生、发展。陈雅静等[19]报道, 2型糖尿病患者血清MMP-9含量明显升高,其升高程度与血压呈正相关。糖尿病引起MMP-9升高的具体机制的研究尚处于初步阶段，有待进一步探索。

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