三种多糖对抗人红细胞 A、B抗原单克隆抗体稳定性的影响

张坤娟,邓郁青,弋国红,张红中*,王从印,张雪迎,王惠芬

(1河北医科大学生物医学工程中心,石家庄 050017;2河北医科大学基础所)

抗 A、抗 B血型定型试剂是 ABO血型鉴定的必需试剂。目前临床使用的均为单克隆抗体(以下简称单抗)血型试剂,其优点为生产成本低、节约血资源、特异性高、亲合力好、操作简单方便,但稳定性欠佳,主要表现为邻近效期,抗体效价下降。已有文献报道,海藻糖对单抗的热稳定性具有保护性作用[1]。2002～2005年,我们观察了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖对抗人红细胞 A、B抗原腹水型单抗稳定性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 三株抗人红细胞 A抗原杂交瘤细胞和三株抗人红细胞 B抗原杂交瘤细胞,均分泌 IgM型抗红细胞抗原单抗,由河北医科大学生物医学工程中心提供。将 1×105个杂交瘤细胞注入 BABL/c小鼠腹腔,7～10 d后可见腹腔有腹水产生,用注射器针头抽取腹水,制备抗人红细胞 A、B抗原腹水型单抗备用。葡萄糖、蔗糖、麦芽糖均购自北京化工厂,分析纯。人 A、B、O型红细胞购自上海血液生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含多糖抗体稀释溶液的制备 定量称取葡萄糖、蔗糖、麦芽糖,加入生理盐水中制备成葡萄糖、蔗糖、麦芽糖稳定溶液。将三株抗人红细胞 A抗原单抗腹水和三株抗 B抗原单抗腹水分别等比例混合后,按 6%体积比加入至 3组多糖溶液中,并加入终浓度为 1∶2 000的叠氮钠防腐,制备成抗红细胞抗原的单抗含糖稀释溶液。

1.2.2 抗人红细胞 A、B抗体效价测定 将待测腹水抗体溶液用生理盐水进行 2倍连续稀释,0.2 ml/管,稀释至第 10管,第 11管做生理盐水对照,加入等量相应血型的 2%红细胞悬液振荡混匀,室温放置 15m in,1 000 r/min离心 1 min后观察结果,以产生“+”凝集的待检液最高稀释度计算效价。

1.2.3 三种多糖有效稳定浓度的确定 将已制备的含不同浓度糖的单抗稀释溶液放置 56℃、30 min,并测定加热前后抗体效价,确定有效稳定浓度。结果置 56℃、30min后,抗 A盐水组抗体效价滴度下降明显,抗 B盐水组抗体已测不出凝集效价,0.1～0.8mol/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖溶液对单抗效价均有一定稳定作用,同一种多糖高浓度的稳定效果优于低浓度,蔗糖和麦芽糖稳定作用优于葡萄糖,三种多糖的最佳有效稳定浓度为 0.4mol/L。

1.2.4 三种多糖对抗人红细胞单抗抗体效价的影响 根据 1.2.3有效稳定浓度的初筛结果,按1.2.1分别制备浓度为 0.4 mol/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖红细胞单抗稀释溶液,分别计为葡萄糖组、蔗糖组、麦芽糖组,同法制备生理盐水对照(盐水组)单抗稀释溶液,均置 37℃、室温、4℃三种温度条件存放,定期监测抗体效价变化,监测时间间隔分别为 1周(共 8周)、4周(共 6个月)和 3个月(共 24个月)。

2 结果

37℃、2周时,葡萄糖、蔗糖、麦芽糖组抗体效价均未降低,盐水组抗 A效价由放置前的 1∶512降至1∶128、抗 B效价由 1∶256降至 1∶64。 4周时 ,三种多糖组抗 A效价仍未降低,抗 B效价蔗糖组未降低、葡萄糖和麦芽糖组降低了 1个稀释度;抗 A效价盐水组则降为 1∶64、抗 B降为 1∶8。 8周时,盐水组已测不出凝集效价,抗 A、抗 B效价蔗糖组分别下降了 1和 2个稀释度、葡萄糖和麦芽糖组下降了 2和 3个稀释度。室温、4个月时,三种多糖组抗体效价保持不降,盐水组抗 A效价降至 1∶64、抗 B降至1∶32。6个月时,抗 A效价盐水组降至 1∶4,蔗糖和麦芽糖组未降,葡萄糖组下降了 1个稀释度;抗 B效价盐水组已检测不出阳性结果,蔗糖组下降了 1个稀释度,麦芽糖和葡萄糖组效价分别下降了 2和3个稀释度。4℃时盐水组抗 A、抗 B效价 6个月时均未降低,12个月时均下降 1个稀释度,18个月时下降 3个稀释度,24个月抗 A降至 1∶16、抗 B降至1∶4;而各多糖组抗 A、抗 B效价保存至 24个月时仍保持不变。

3 讨论

正确测定和判读受血者和献血者的血型是临床输血的关键,而具有稳定可靠质量的血型定型试剂是保证正确测定的前提。目前,临床常用的国内单抗血型定型试剂与进口试剂相比在稳定性等方面还存在一定差距,主要表现为随储存时间的延长或非冷链运输等原因,血型试剂效价有不同程度地下降,凝集强度变弱,对于一些抗原性较弱的血样,可能发生血型的错误判读[3,4]。

解决血型单抗试剂长期保存稳定性降低的方法主要有两种,一是增加试剂中抗体的含量,提高血型单抗初始效价;另一种是加入适量的抗体蛋白稳定剂,如一定量的小鼠腹水、腹水提取蛋白或酪蛋白等。前一种方法需要消耗大量的人力物力,增加试剂的成本,而加入适当的稳定剂则更为方便实用。本研究结果显示,不同血型抗体的稳定性存在差异,放置温度对血型试剂的效价有很大影响,0.1～0.8 mol/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖对抗 A、B单抗均有一定的稳定作用,高浓度稳定效果优于低浓度,三种多糖中以蔗糖稳定作用最好。以 0.4 mol/L葡萄糖、蔗糖、麦芽糖作为稳定剂,在 37℃下腹水单抗的效价可延长至 2～3周;在室温条件下,效价可延长至4～6个月;在 4℃下,效价可延长至 24个月。

综上所述,临床血型试剂不宜在较高温度条件下长时间放置,平时应 4℃保存。采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖(尤其是蔗糖)作为稳定剂,可明显提高单抗的稳定性,有效延长抗体的使用期限,降低生产成本。

[1]计融,江涛,李业鹏,等.海藻糖对单克隆抗体热稳定性保护作用的研究[J].中国食品卫生杂志,2001,13(2):10-12.

[2]中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程 [M].北京:化学工业出版社,2000:601-604.

[3]黄丽雅,陈勇高,周越勤,等.抗 A和抗 B血型定型试剂稳定性观察及对亚型检测的影响[J].现代检验医学杂志,2007,22(6):20-23.

[4]孙爱农,冯志广,李兆兰,等.单克隆抗 -A(B)试剂质量鉴定与分析[J].中国误诊学杂志,2004,4(1):34-36.