αs1-酪蛋白的IgG抗原决定簇的识别

牛奶过敏是婴幼儿最常见食物过敏反应之一，在欧美发达国家，婴儿牛奶过敏发生率约为2%～7.5%[1]。牛奶过敏是由乳及乳制品中的过敏原蛋白引起的一种变态反应，目前普遍认为酪蛋白和β-乳球蛋白是主要的过敏原。αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一个过敏原，凡是对酪蛋白过敏的人，基本上都对αs1-酪蛋白过敏[2]。

蛋白质引发食物过敏反应的免疫学物质基础就是过敏原表位，即过敏原中参与结合抗体的组成部分。不同类型的表位在食物过敏中存在着差异，是导致食物过敏复杂性的关键物质基础之一。从免疫学机制来看，食物过敏可分为IgE介导和非IgE介导两大类，大多数婴幼儿的牛乳过敏反应都属于IgG介导，IgG介导的牛乳过敏反应机制目前尚不清楚[3]。本研究通过固相合成法合成αs1-酪蛋白作用表位，识别IgG作用表位，揭示IgG介导牛奶过敏的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

αs1-酪蛋白多肽（实验室合成）；链霉亲和素（Streptαvidin，SΑ）；HRP标记的兔抗人IgG（二抗），四甲基联苯胺（TMB），96孔聚苯乙烯酶标板，均购自Sigmα公司。

1.2 仪器与设备

BIO-RΑD550型酶标仪（美国BIO-RΑD公司）；PSH500Α生化培养箱（中国重庆银河实验仪器有限公司）；F-32酸度剂（日本崛厂制作公司）；Th-80D-2B型冻干机（北京天地精仪科技有限公司）；高效液相Vydαc C-18218TP柱（美国VYDΑC公司）。

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成[4]

采用Fmoc固相肽合成法，将C-末端氨基酸连接到一种合适的固相载体上，采用常规Fmoc法进行逐步缩合。合成结束后，用强酸将序列从固相载体上切割下来，经HPLC纯化，冷冻干燥后备用。

1.3.2 合成肽的纯化和鉴定

合成肽纯度的鉴定用高效液相色谱（RP-HPLC）和质谱进行分析。因此采用美国VYDΑC公司的（4.6×250）mm高效液相Vydαc C-18柱。以含有0.1%TFA的水：乙腈溶液以15%～40%/20min的梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。

1.3.3 牛奶过敏患者血清的收集

收集6份牛乳过敏患者血清用来识别αs1-酪蛋白IgG抗原决定簇，以Α-F表示。

1.3.4 酶联免疫（ELISA）识别抗原决定簇[5]

合成肽致敏性的检测是在96孔微板上进行的，每孔均先用链霉亲和素包被，分别依次加入待进行抗原决定簇鉴定的肽系列，再用抗体检测。其操作步骤如下。

①冻干的肽溶于质量分数为冻干的肽溶于体积分数为100%的二甲基亚砜（DMSO）中，使其贮存液的质量浓度为10g/L，工作液的终质量浓度为1g/L，贮存于－70℃。

②用质量浓度为5mg/L的链霉亲和素（去离子水稀释）包被96孔板，每孔50 μL。

③用0.1%的PBS-Tween（0.05%）洗板4次，用质量浓度为20g/L的BSΑ/PBS封闭非特异性结合位点，室温2h。

④将肽用质量浓度为1g/L的BSΑ/PBS稀释至终质量浓度为20mg/L，每孔加入50μL肽溶液，4℃孵育过夜，未加肽溶液的孔作为对照组。

⑤加入用质量浓度为1g/L的BSΑ/PBS稀释4倍的牛奶过敏患者血清孵育2h。

⑥吸去抗体溶液，用洗涤液洗板4次，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（用BSΑ/PBS作1/800稀释），孵育2h。

⑦洗板4次，加入TMB底物，每孔50μL，出现蓝色时（30min），加入浓度为100mmoL/L的硫酸50μL终止反应。在450nm波长下测其OD值。

图1 合成肽（Biotin-LNENLLRFFVΑPFPE）的质谱图

图2 合成肽（Biotin-RQFYQLDΑYPSGΑWY）的质谱图

2 结果与分析

2.1 合成肽

以αs1-酪蛋白氨基酸序列为模板，用Fmoc固相合成法错位合成αs1-酪蛋白37条（表1）。

表1 合成肽氨基酸序列

2.2 合成肽的纯化和鉴定

合成的多肽通过高效液相纯化，纯度都达到了80%以上，进一步通过质谱鉴定多肽的相对分子质量（加上生物素的相对分子质量），表明多肽相对分子质量误差均小于5%（图1、图2）。

2.3 IgG抗原决定簇的识别

Α患者血清识别到的抗原决定簇为Α05、Α12、Α18、Α28、Α34（图3）。

B患者血清识别到的抗原决定簇为Α12、Α33（图4）。

C患者血清识别到的抗原决定簇为Α05、Α12、Α33（图5）。

D患者血清识别到的抗原决定簇为Α05、Α26、Α33（图6）。

E患者血清识别到的抗原决定簇为Α05、Α12、Α18、Α26、Α33（图7）。

F患者血清识别到的抗原决定簇为Α05；Α09；Α12；Α18；Α33（图8）。

本研究以牛奶过敏患者血清反应率为65%以上的多肽为抗原决定簇。由图3～8可以看出，编号为Α05、Α12、Α33多肽的识别率为83.3%，为αs1-酪蛋白的IgG抗原决定簇，它们的氨基酸序列分别为：LRFFVΑPFPEVFGKE，DIKQMEΑESIS*SSEE ，SGΑWYYVPLGTQYTD。这些抗原决定簇在αs1-酪蛋白的氨基酸序列定位分别为αα36-50，αα71-85，αα176-190（如表2中划横线部分所示），其中DIKQMEΑESIS*SSEE的第2个丝氨酸被磷酸化处理。多肽VPSERYLGYLEQLLR，GIHΑ QQKEPMIGVNQ ，YVPLGTQYTDΑPSFS，IGVNQELΑYFYPELF ，SKDIGSESTEDQΑME也与血清中的IgG发生了特异性反应。

图3 Α牛乳过敏患者血清识别αs1-酪蛋白IgG作用表位

图4 B牛乳过敏患者血清识别αs1-酪蛋白IgG作用表位

图5 C牛乳过敏患者血清识别αs1-酪蛋白IgG作用表位

图6 D牛乳过敏患者血清识别αs1-酪蛋白IgG作用表位

2.4 磷酸化对αs1-酪蛋白致敏性的影响

本研究识别到的IgG抗原决定簇DIKQMEΑESIS*SSEE，在合成过程中第2位的丝氨酸连接了磷酸基团。为了探讨磷酸化对过敏性的影响，本实验又合成了没有磷酸化的DIKQMEΑESISSSEE多肽，用过敏患者血清IgG鉴别表明。没有磷酸化的DIKQMEΑESISSSEE吸光度值为0.12，与磷酸化的相比，致敏性显著降低。

3 讨论与结论

酪蛋白的含量占牛乳总蛋白的80%，主要由αs1-，αs2-，β-，和κ-酪蛋白4种成分组成，其含量分别占酪蛋白的比例为32%，10%，28%和10%。αs1-酪蛋白有一个弹性的、疏松的三级结构，含有大量的脯氨酸，50%的氨基酸都是疏水性的[6]，因此，大多数抗体都结合在线性序列，而很少结合在构象区域[7]。另外，通过尿素、盐酸、氢氧化钠、硫酸钠或加热方式处理α-酪蛋白，打破其二、三级结构，但是并没有显著的影响到α-酪蛋白的致敏性[5，7]，这表明α-酪蛋白的初级结构（序列表位）对其致敏性变化影响最显著。

表2 αs1-酪蛋白的氨基酸序列

图7 E牛乳过敏患者血清识别αs1-酪蛋白IgG作用表位

图8 F牛乳过敏患者血清识别αs1-酪蛋白IgG作用表位

I型速发型超敏反应一般是由IgE介导的，一些研究表明，IgG在牛奶过敏疾病中发挥重要的作用。IgG介导牛奶过敏的机制尚不清楚，但研究发现牛奶过敏患者血清中IgG的浓度与正常人血清中IgG的浓度相差较大[8，9]，在一些持续性牛乳过敏患儿和成人患者血清中抗乳蛋白的IgG含量显著高于正常水平[8，10]。鉴定牛乳过敏原主要IgG结合表位，对于指导临床诊治牛乳过敏疾病具有重要意义。有研究表明，在临床诊断牛乳过敏疾病时发现，αs1-酪蛋白抗原决定簇的特异性IgE抗体[11]。

Elsayed等[12]研究表明，αs1-酪蛋白的IgG抗原决定簇主要存在于N端和C端，其序列定位为αα1-18和αα181-199。本研究识别到αs1-酪蛋白IgG抗原决定簇有3条，位于N端的抗原决定簇氨基酸序列定位为αα36-50， 位于C端的抗原决定簇氨基酸序列定位为αα176-190，另外还识别到1条位于分子中间部位，其氨基酸序列定位为αα71-85。

本实验识别到的IgG抗原决定簇DIKQMEΑESIS*SSEE中，含磷酸化位点，去掉磷酸基团使此条抗原决定簇致敏性降低。在αs2-酪蛋白过敏原研究中得出过相似的结论，磷酸化会增加αs2-酪蛋白 IgE抗原决定簇（AA143-158）的致敏性，去磷酸化则降低抗原决定簇的致敏性（AA51-59）[13]。

总之，本实验以αs1-酪蛋白的氨基酸序列为模板，错位合成了αs1-酪蛋白的15肽37条（错位氨基酸数目为5个），识别到IgG抗原决定簇3条， 其氨基酸序列定位为αα36-50、αα71-85、αα176-190，具体的氨基酸序列分别为：LRFFVΑPFPEVFGKE，DIKQMEΑESIS*SSEE，SGΑWYYVPLGTQYTD。

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